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《中国人民解放军军事医学科学院》 2005年
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Smad5基因在小鼠胚胎干细胞增殖、分化及凋亡中的功能与机制

孙彦洵  
【摘要】:Smad5是转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)家族细胞质内重要的信号转导分子。Smad5属于受体激活型Smads,受TGF-β亚家族成员BMP信号的调控。先前的研究表明Smad5基因剔除小鼠在胚胎期E11.5天前死于多种胚胎及胚外组织缺陷,表明Smad5对于体内心血管系统的发育是必需的。为了进一步研究Smad5基因的功能,我们利用Smad5双等位基因缺失的ES细胞系体外定向诱导ES细胞分化为心肌细胞。我们发现Smad5~(ex6/ex6)突变型ES细胞体外分化所形成的心肌细胞肌小管在形态学上出现塌陷与囊性病变;电子显微镜观察到分化所形成的突变型心肌细胞中和小鼠胚胎心脏中均出现大量的心肌细胞凋亡并伴有线粒体肿胀。在对凋亡发生机制进行研究的过程中,通过Western Blotting检测发现在Smad5~(ex6/ex6)突变型的心肌细胞中,p53表达上调并伴有细胞色素C释放增加。激光共聚焦显微镜检测Smad5~(ex6/ex6)突变型的心肌细胞中线粒体膜电位下降。这些结果表明Smad5介导的TGF-β信号可能通过p53介导的线粒体途径保护心肌细胞免于凋亡。 我们在未分化的ES细胞培养过程中发现,Smad5基因缺失能够导致ES细胞增殖速度加快。为此我们探讨了Smad5基因缺失对ES细胞凋亡发生的影响,我们采用UVC(p53依赖的凋亡刺激)和阿霉素(p53非依赖的凋亡刺激)来诱导ES细胞发生凋亡,发现Smad5基因缺失ES细胞对凋亡发生易感,这种凋亡的增加与p53和Bcl-2蛋白的表达水平都有关。 尽管在未分化的ES细胞以及分化的心肌细胞中我们都观察到了凋亡增加的现象,然而这种凋亡发生的异常是由于各个胚层的发育的改变所引起?还是Smad5基因缺失所导致的直接结果?仍然是我们最感兴趣的科学问题。由于ES细胞在体外分化所形成的拟胚体在结构上能够模仿早期胚胎发育过程,包括在内细胞团表面形成内胚层,柱状上皮细胞的分化以及中央空腔的形成。为了进一步研究Smad5基因缺失对小鼠胚胎发育早期各个胚层的影响及Smad5基因与凋亡发生的关系。我们利用ES细胞体外分化形成拟胚体,发现Smad5基因缺失的拟胚体在发育过程中凋亡增加,细胞排列紊乱;半定量RT-PCR显示Smad5基因缺失导致BMP2和BMP4在拟胚体发育早期表达增强。由于BMPs信号在许多
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