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蓖麻毒素A链及其突变体的表达、纯化和分析

孙嗣梅  
【摘要】:蓖麻毒素(ricin toxin,RT)为一种植物来源的、毒性强的蛋白质毒素,其全毒素是由A、B两条多肽链(RTA、RTB)和连接两链的二硫键组成的异二聚体,分子量在62000~66000Da之间。由于毒性强、易于获得和可气溶胶化等特点,RT已成为重要的生物战剂和生物毒素恐怖剂之一。 本实验首先根据RTA链中已明确的关键性氨基酸残基位点,设计了三个突变体RTA(mRTA)旨在降低RTA的毒性和消除RTA链易发生血管渗漏综合征弊端,即mRTAD75AV76MY80A、mRTAD75AV76MY123A和mRTAD75AV76ME177D(以下简称mRTAY80A,mRTAY123A,mRTAE177D).经Lasergene软件包中Protean程序分析和预测,它们的氨基酸亲水性、抗原指数和表面可及性预测图谱与非突变体(RTA)蛋白的预测图谱基本一致,说明mRTAY80A、mRTAY123A和mRTAE177D三个mRTA的抗原性未发生变化。 然后以含RTA基因的pUC19-RTA为模板,通过PCR方法扩增出RTA基因,又通过定点突变技术获得三种mRTA基因,即mRTAY80A,mRTAY123A,mRTAE177D。上述基因分别连接至pMD18-T载体进行序列分析鉴定,结果表明,PCR扩增的RTA基因序列与GenBank中所报道的RTA基因序列完全一致;三个mRTA基因也按照预先设计要求发生了相应的突变。然后以EcoRⅠ和NheⅠ对pMD18-TRTA、pMD18-TmRTAY80A、pMD18-TmRTAY123A、pMD18-TmRTAE177D和原核表达载体pET-His进行双酶切,按常规方法进行连接,获得四个重组表达质粒pET-HisRTA、pET-HismRTAY80A,pET-HismRTAY123A,pET-His mRTAE177D。经过双酶切和PCR鉴定正确后,分别转化到E.coliBL21(DE3)plysS感受态细胞中,构建了4个相应的表达工程菌。分别在30℃、37℃,经0.4mM IPTG诱导培养2~4h后,4个表达工程菌的SDS-PAGE分析显示,均有一条相对分子量约32kDa的表达蛋白区带,与RTA相对分子量相符。其中,重组RTA(rRTA)蛋白呈现可溶性表达和包涵体表达两种形式,且rRTA蛋白可溶性的表达量约占全菌蛋白的18.45%;其余三个mRTA蛋白均为包涵体形式,目的蛋白表达量依次为17.21%、26.22%、32.79%。 根据重组蛋白N端带有6×His标签的特征,用螯合镍离子次氨基三乙酸(Ni-NTA)的亲和层析柱对重组蛋白进行一步纯化。其中,在非变性条件下rRTA经咪唑浓度梯度洗脱,目的蛋白在含100raM咪唑的洗脱液中被洗脱下来,经TotalLab2.0图像软件分析纯化蛋白的纯度达97.53%左右,lL工程菌培养液可纯化到约18mg的rRTA蛋白;在变性条件下,三种mRTA蛋白经pH梯度洗脱,


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