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《中国人民解放军军事医学科学院》 2005年
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利用精子载体方法研制人组织型纤溶酶原激活剂突变体转基因羊乳腺生物反应器

叶华虎  
【摘要】:利用转基因动物乳腺生产医药用蛋白,具有产量高和生产成本低等明显优势,前景普遍看好,但动物乳腺生物反应器的获得有赖于可靠的转基因动物生产制备技术作保证。 精子介导基因转移(Sperm-mediated gene transfer,SMGT)被认为是目前操作最简单的转基因动物生产技术,但该方法的重复性差、实验结果不稳定,因此也是一种不成熟的技术体系。基于SMGT的不成熟性,本实验将对SMGT的几个关键环节进行研究,以期建立稳定、高效的SMGT技术平台,同时利用该技术平台研制人组织型纤溶酶原激活剂突变体(variant form of human tissue-type plasminogen activator,mt-PA)转基因羊乳腺生物反应器,为安全高效的溶栓药物mt-PA规模化生产奠定基础。实验结果如下: 1)山羊精子可自发性结合外源DNA,精子对外源DNA的结合和内化能力在不同个体间差异显著(P0.01)。对于同一供体的精子而言,阻止DNA结合的最主要因素是精浆,离心洗涤后,结合率和内化率可提高数倍。 2)死精子同样能结合外源DNA,但不能将其内化,反复冻融导致质膜破裂的死精子具有更高的结合率,而且与动物个体无关。 3)精浆既可能与DNA形成复合物,改变DNA的物理性质,又可能对游离DNA产生降解,精浆的作用效应呈浓度和时间依赖性;EGTA对精浆的复合效应和降解效应有明显的抑制作用。 4)内化进入精细胞中的外源DNA大部分将被降解,EGTA/ATA能有效保护内化DNA的完整性而不影响精子的其他生物学特性。 5)转染精子用于体外受精,报告基因GFP可被精子介导进入卵母细胞,并在早期胚胎中表达,胚胎阳性率和GFP表达率与精子结合外源DNA的能力相关。 6)精子与山羊乳腺特异性表达pBGC-mtPA线性化质粒DNA共同孵育后,人工受精得到129只羔羊,其中24只PCR阳性(阳性率18.6%),15只Southern blot阳性(阳性率11.6%,15/129)。但转染精子受精能力下降,畸形羔羊增多,生产的转基因羊部分可能是嵌合体或者是部分片段整合。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:R346

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 王晓利;荧光蛋白标记的t-PA EGF缺失基因在鸡体内定位表达及靶向转运[D];河南科技大学;2011年
2 周咏松;组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体乳腺特异性表达载体的构建及其细胞表达研究[D];扬州大学;2008年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前3条
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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2 姚雪静;PRRSV安徽株的分离鉴定及感染仔猪病理学的研究[D];安徽农业大学;2010年
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【同被引文献】
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中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 任芳丽;山羊乳腺上皮细胞的分离与体外培养[D];西北农林科技大学;2002年
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【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
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【相似文献】
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3 王晖;周作民;徐珉;李建民;沙家豪;;人精子中精子发生相关基因谱系的构建及初步临床应用[A];江苏省遗传学会第七届代表大会暨学术研讨会论文摘要汇编[C];2006年
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10 张立营;曾梅;孙华钦;陈朴;张思仲;马用信;;小鼠T-STAR蛋白靶mRNAs的分离及鉴定[A];中国遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编(2004-2008)[C];2008年
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3 王大明;精索静脉曲张和年龄对精子DNA完整性的影响[D];安徽医科大学;2013年
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5 严阿勇;小鼠胞浆内精子注射的研究[D];中国农业大学;2004年
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7 王伟;马达蛋白在嘉庚蛸精子发生过程中作用的分子机制[D];宁波大学;2010年
8 熊小芳;精子介导的乙肝病毒基因在早期鼠胚中的复制与表达[D];汕头大学;2005年
9 刘容菊;精液优选前后精子质量评价指标的研究[D];汕头大学;2006年
10 柳强;奶牛X-,Y-精子抑制消减文库的构建[D];内蒙古农业大学;2009年
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