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人肝脯氨肽酶基因的克隆表达及其生化药理学性质

王淑豪  
【摘要】:有机磷化合物如梭曼(Soman)、沙林(Sarin)、塔崩(Tabun)、对氧磷(Paraoxon)和对硫磷(Parathion)等是一类不可逆地抑制胆碱酯酶(AchE)的剧毒化合物,主要作为化学武器或农药使用。对AchE的不可逆抑制导致神经系统中胆碱能神经功能亢进可用可逆性AChE抑制剂(如氨基甲酸酯)进行预防,用抗胆碱能药物对症治疗及使用肟类药物使有机磷化合物抑制的胆碱酯酶重活化。尽管用这些抗毒措施在防治有机磷化合物中毒时可免除死亡,但却不能很有效地控制染毒后的失能状态和毒性效应。一个新的有效的办法是用毒剂水解酶将有机磷毒剂在其未到达神经系统靶分子乙酰胆碱酯酶和胆碱受体之前在血流中水解掉。有机磷酸酸酐水解酶(Organophophorus acid anhydrolase,OPAA)[E.C.3.1.8.2],广泛存在于原核和真核生物组织中,动物实验表明肝脏和肾脏中含有丰富的有机磷化合物水解酶活性,它对有机磷化合物的高效催化水解作用已引起人们的极大关注。 我室王青定分离纯化了人肝梭曼水解酶,经电泳转印至PVDF膜后,测定了其N端10个氨基酸残基序列,序列对比显示此序列与人肝脯氨肽酶(Prolidase)[E.C.3.4.13.9]N端序列9~18个氨基酸残基有90%的同源性,得到的人肝Soman水解酶序列除缺少编码N末端前8个氨基酸的核酸序列及编码的第2个氨基酸由W变为P外,其余均与Prolidase相同。美国军事生化防御部郑笃诚等研究发现,嗜盐菌交替单胞菌属(Alteromonas)菌株胞内含有高浓度的OPAA,水解Soman和Sarin,此酶氨基酸序列与脯氨肽酶具有较高的同源性,确定两者由同一祖先的基因进化而来。 本研究以人肝为材料,从中克隆了人肝Prolidase基因,采用重组DNA技术构建人肝Prolidase三个不同表达系统的重组质粒,分别在原核表达系统、酿酒酵母表达系统和毕赤酵母表达系统进行了表达,通过离子交换层析及凝胶过滤层析对重组蛋白进行了纯化,并探讨了其生化药理性质。主要内容如下: 1 根据文献报道的人肝Prolidase核酸序列,通过计算机辅助设计人肝Prolidase基因的引物。从人肝中提取总RNA,以此RNA反转录PCR获得的cDNA为模板,用所设计的引物进行PCR扩增,其产物经回收纯化,利用PinPoint-T载体顺利地克隆了人肝Prolidase基因,大小约1.5kb,基因全序列分析表明获得的Prolidase基因与报道序列完全相同。 2 将Prolidase基因克隆至原核表达载体pGEX4T-1中,构建了重组表达质粒pGEX4T-1-P。转化大肠杆菌BL21,获得表达菌株。IPTG诱导实现了人Prolidase基因在大肠杆菌中的表达,重组蛋白以不溶性包涵体形式存在。凝胶密度扫描分析表明,表达量约占菌体总蛋白的21%。包涵体经分离、变性、复性


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