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《中国人民解放军军事医学科学院》 2003年
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免疫分子的锚定修饰及其抑瘤效果的初步研究

程绍辉  
【摘要】:如何打破肿瘤的免疫逃避机制,重新唤醒免疫系统对肿瘤细胞的识别和杀伤的能力,是肿瘤免疫治疗的关键。本文应用“细胞表面修饰”手段,对肿瘤细胞膜表面进行修饰,从而达到增强机体对肿瘤细胞的抗原提呈、促使T淋巴细胞激活,改善局部的免疫微环境的目的。本课题主要做了如下几方面的工作: 1 GPI锚定修饰的真核表达载体和载体的改构 GPI锚定的真核表达载体pCI-GPI本室已经构建,在此基础上进行了载体的改构工作。该载体中连接有衰变加速因子(DAF)来源的GPI修饰性信号序列和人IgGFc段的融合基因,外源基因通过GPI信号肽修饰可使得新生蛋白与GPI(Glycosylphosphatidy-1-inositol,糖基化磷脂酰肌醇)结构在内质网内连接形成GPI锚定蛋白,并以其脂质性尾部整合到细胞膜表面。人IgG Fc段及GPI修饰性信号肽的融合基因片段定向插入于pCI-dhfr~+真核表达载体的EcoRI和XbaI酶切位点之间,命名该载体为pCI-GPI载体。在此基础上又进行了一定的载体改构工作,以EcoRI/NotI双酶切Fc-GPI融合基因片段,并连接于pCI-neo真核表达载体上,该载体有新霉素的抗性基因,同时在该载体上连接了鼠Igκ链V-J2-C区域的分泌信号肽序列,以利于外源基因的分泌表达。 2 mGM-CSF的锚定修饰以及对B16小鼠黑色素瘤抑瘤效果的初步研究 为了证明免疫分子经锚定修饰后,是否保留有生物学活性和免疫分子经锚定表达后是否有更好的抑瘤效果,我们锚定修饰GM-CSF于B16小鼠黑色素瘤细胞表面,通过动物实验研究观察GM-CSF锚定修饰的抑瘤效应,为开展其他免疫分子锚定修饰的系列研究打下基础。 应用RT-PCR技术从小鼠脾淋巴细胞中钓取mGM-CSF全长基因,扩增片段连接于pGMT-easy载体后,测序正确后,插入PcDNA3.1真核表达载体上,命名为PcDNA3.1-mGM。此外扩增mGM-CSF基因以NheI/EcoRI酶切连接于pCI-GPI真核表达载体上,酶切鉴定证实连接于Fc-GPI融合基因的上游,命名为pCI-GPI-mGM。利用脂质体转染的方法分别转染上述两个质粒于B16小鼠黑色素
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R392

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