咪唑啉I_1受体稳定表达系统的建立及其功能和信号转导的初步研究
【摘要】：咪唑啉受体(Imidazoline Receptor,IR)是八十年代以来逐渐被认识的一种新型受体,目前证实IR主要分为I_1R和I_2R两大类。I_1R参与体内许多重要的生理功能,如血压调节,胰岛素分泌等,并参与了抑郁症、早老性痴呆等疾病的病理过程,已成为新的治疗靶标。国际上对I_1R的研究工作尚处于初级阶段,研究中遇到的最大困难之一是缺少单独研究I_1R的合适的细胞模型。如能建立合适的I_1R细胞模型,有助于I_1R的生物学功能及信号转导通路的研究,有助于开发新型药物。
Piletz用两种IR蛋白抗血清从人脑海马λgt11 cDNA文库中,成功克隆了全长5131bp的I_1R-cDNA序列,并将其构建为重组质粒。我们用[~3H]-咪唑克生特异性结合实验证明在1-48nM范围内,中国仓鼠卵巢(CHO)细胞未表现出α_2肾上腺素受体(α_2R)和I_1R的结合位点,可用于建立专一表达I_1R的细胞模型。
本研究用脂质体介导的方法,将I_1R重组质粒稳定转染到CHO细胞中。以氨基糖苷磷酸转移酶(neo,G_(418))为选择标记,筛选出34株稳定转染了I_1R重组质粒的CHO单克隆细胞系。以与标记配体[~3H]-咪唑克生是否有特异性结合为筛选标准,在34株细胞中初筛发现19株细胞不同程度地表达了I_1R。以与标记配体~3H-咪唑克生特异性结合值的高低为筛选标准,复筛得到7株细胞有较高水平的表达。继续筛选得到I_1R-19和I_1R-6两株细胞系。选取I_1R-19细胞株进行进一步研究。
经受体饱和实验,发现I_1R-19细胞株制备的膜蛋白与标记配体[~3H]-咪唑克生和[~3H]-可乐定的结合均具有特异性、可饱和性,且对两种标记配体的亲和力大小和受体密度相同([~3H]-咪唑克生:Kd=15.8±10.4nM,B_(max)=713.3±102fmol/mg·蛋白;[~3H]-可乐定:Kd=16.7±3.7nM,B_(max)=742±17fmol/mg·蛋白)。采用全细胞受体饱和结合实验也可得到相似结果([~3H]-咪唑克生:Kd=23.1±2.9nM,B_(max)=178.4±7.4fmol/10~6细胞:[~3H]-可乐定:Kd=23.3±10.4nM,B_(max)=122.1±1.6fmol/10~6细胞)。不同配体的竞争抑制实验表明IR激动剂莫索尼定和可乐定,拮抗剂咪唑克生均能抑制I_1R-19细胞与[~3H]-可乐定的结合,而α_2R受体激动剂NE不能竞争抑制I_1R-19细胞与[~3H]-可乐定的结合。进一步证实转染得到的配体结合位点具有I_1R结合位点的特
【关键词】：咪唑啉I_1受体 中国仓鼠卵巢细胞 稳定表达 细胞模型 细胞保护 细胞增殖 信号转导 钙 【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士后
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R96
【DOI】：CNKI:CDMD:1.2005.152493
【目录】：
- 中文摘要6-8
- 英文摘要8-10
- 英文缩写10-11
- 引言11-13
- 第一部分 咪唑啉I_1受体哺乳动物细胞稳定表达系统的建立13-36
- 前言13-14
- 实验材料和方法14-25
- 实验材料14-15
- 质粒扩增提取与鉴定15-18
- 细胞培养与稳定转染18-21
- 配体结合筛选实验21-22
- 饱和结合实验22-24
- 竞争抑制结合实验24
- 细胞传代实验24-25
- 实验结果25-33
- I_1重组基因鉴定25
- CHO细胞受体结合分析25-26
- 高特异结合细胞株的筛选26-28
- I_1R-6和I_1R-19细胞株膜受体饱和结合实验28-29
- I_1R-19细胞株与不同标记配体的结合特征29-31
- 不同配体的竞争抑制结合实验31
- 表达稳定性考察31-33
- 讨论33-35
- 参考文献35-36
- 第二部分 咪唑啉I_1受体功能及信号转导的初步研究36-62
- 前言36-40
- 实验材料和方法40-47
- 细胞生长曲线测定40-41
- 细胞损伤反应性测定41-42
- 细胞增殖能力测定42-43
- [~(35)S]-GTPγS结合实验43-44
- 细胞内游离钙离子浓度测定44-47
- 实验结果47-56
- I_1R对细胞损伤的保护作用47-50
- I_1R的细胞增殖作用50-51
- 可乐定对CHO-I细胞G蛋白与[~(35)S]-GTPγS结合的影响51
- I_1R激活对胞内游离钙离子浓度的影响51-56
- 讨论56-59
- 参考文献59-62
- 结语62-63
- 致谢63-64
- 附录 咪唑啉I受体与磷脂代谢相关的信号转导研究进展64-73
- 个人简历73
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