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《中国人民解放军军事医学科学院》 2006年
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VEGFR胞外结合域(KDR3)基因的克隆表达及功能研究

何立丽  
【摘要】:肿瘤的生长和转移依赖于血管的生成,抗血管生成疗法是一个正在兴起的肿瘤生物治疗的新途径。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是最主要的调节因子,通过与受体的相互作用刺激血管内皮细胞增殖,促进肿瘤的增长和转移。由于人VEGFR Ⅱ(KDR)编码1354个氨基酸,对其进行表达和功能研究存在一定难度,因而选取其主要功能部位进行研究。已有的实验提示在其7个免疫球蛋白区域中区域3对于VEGF的结合贡献最突出。 本实验经查阅参考文献及利用计算机分子模拟系统对KDR3与VEGF的结合的关键位点进行了分析,设计并构建了三个KDR3突变体:M1、M2、M3。首先,从人脐静脉内皮细胞中提取总RNA,利用RT-PCR方法克隆了人KDR3成熟肽的cDNA序列,利用重叠延伸PCR方法获得了各突变体的DNA片段。然后,将它们分别插入pET-His载体中,构建重组质粒,利用E.coli BL21进行了表达,结果表明相应工程菌目的蛋白在大肠杆菌中的表达产物以包涵体形式存在,包涵体经洗涤后以Sephacryl-200凝胶柱层析进行纯化,纯化蛋白在还原型和氧化型谷胱甘肽组成的氧化还原体系中进行复性,获得了纯度达90%以上野生型及突变体KDR3的蛋白纯品,为可溶性受体治疗肿瘤打下基础。 最后,构建诱饵蛋白载体PAS2-1-KDR3及目的蛋白载体PACT-2-VEGF,并分别转化至酵母菌株Y190中,对KDR3及VEGF分析,结果表明二者均不具有转录激活活性。在酵母系统中验证KDR3和VEGF的相互作用,结果未能检测到两者的相互作用,随后在人胎肝cDNA文库中对KDR3的结合蛋白进行筛选。 本实验结合生物信息学、体外重组技术、细胞培养、酵母双杂交等方法,对KDR3功能进行了研究,针对它的拮抗剂有可能成为一种高效的抗肿瘤药。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R73-3

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【参考文献】
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【共引文献】
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