收藏本站
《中国人民解放军军事医学科学院》 2006年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

SARS-CoV BJ01株全长cDNA的构建及其S基因突变对病毒感染性的影响

韩剑峰  
【摘要】:SARS-CoV为一种新发现的人冠状病毒,属于单股正链RNA病毒,基因组全长约30kb,是已知的RNA病毒中基因组最大的一类病毒。SARS-CoV基因组结构为5'-Rep-S-E-M-N-3’,编码4种结构蛋白和多种非结构蛋白。其中刺突蛋白S为病毒最重要的结构蛋白,参与病毒与细胞受体的结合以及入侵宿主细胞的膜融合过程,决定着病毒的组织嗜性和毒力。 目前对SARS-CoV基因组结构与功能、致病的分子机理并不十分清楚,对于病毒基因组中与毒力相关的位点大多为生物信息学预测,确切的毒力位点尚未得到实验验证。由于SARS-CoV基因组较大而难以构建感染性克隆进行体外突变研究,因此构建病毒基因组全长cDNA可有效解决这一问题,为深入探讨SARS-CoV的基因组结构与功能、致病的分子机理奠定基础。 为此,本研究采用分段克隆、体外拼接策略构建了SARS-CoV BJ01株基因组全长cDNA,经体外转录制备了恢复病毒,观察了恢复病毒对敏感细胞的感染性及传代稳定性;并通过生物信息学方法对BJ01株S蛋白的可能毒力相关位点进行了分析预测和体外突变,构建了突变病毒全长cDNA。进一步观察比较突变病毒的感染性与原型病毒的差异,为寻找SARS-CoV毒力位点和揭示其致病的分子机制提供依据。 首先,构建了本实验室分离的SARS-CoV BJ01株病毒基因组全长cDNA。鉴于冠状病毒基因组较大,设计覆盖病毒全基因组的7对引物将病毒全长cDNA分为7个片段分别进行了扩增。获得的F_1~F_7各cDNA片段大小分别为1.5kb,2.8kb,4.3kb,3.3kb,6.8kb,4.5kb和6.3kb。同时,为实现全长cDNA的体外转录,在病毒基因组5′端引入T7启动子核心序列。将7个cDNA片段分别克隆至pGEM-T Easy、pCR-XL-TOPO、pWSK29等不同载体,构建了BJ01株cDNA亚克隆。然后酶切重组质粒制备目的片段,分别将F_1~F_4和F_5~F_7体外连接获得基因组5′和3′半分子cDNA,再将二者进行体外连接构建BJ01株全长cDNA分子。接头处序列的测序结果表明获得了SARS-CoV BJ01株基因组全长cDNA。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R346

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 陈晓娟;杨宇东;孙莉;胡日查;邢雅玲;陈忠斌;;SARS冠状病毒PLpro蛋白酶对泛素样分子的DUB活性[J];中国生物化学与分子生物学报;2011年07期
2 ;[J];;年期
3 ;[J];;年期
4 ;[J];;年期
5 ;[J];;年期
6 ;[J];;年期
7 ;[J];;年期
8 ;[J];;年期
9 ;[J];;年期
10 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前5条
1 李祥敏;钱平;金梅林;郭东春;徐卓菲;陈焕春;;从口蹄疫病毒基因组全长cDNA转录的感染性RNA[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
2 赵金存;袁志宏;贾汝静;赵振东;徐晓军;吕平;张岩;高晓明;;SARS冠状病毒刺突蛋白450-650片段抗原性及受体结合能力的研究[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年
3 赵睿;罗佳;黄嫣嫣;上官棣华;张红武;刘国诠;;以亲和色谱法筛选SARS病毒亲和抑制剂[A];第十五次全国色谱学术报告会文集(上册)[C];2005年
4 秦莉;王西明;雷明军;潘晖榕;屈伸;吴少庭;袁仕善;黄达娜;高世同;张仁利;林绮萍;温见翔;;SARS冠状病毒S蛋白DNA疫苗的构建及其免疫效果研究[A];中华医学会热带病与寄生虫学分会机会性感染学术研讨会论文汇编[C];2007年
5 余荭;李汀;马永刚;孔晓红;乔文涛;耿运琪;陈启民;;BFV3026感染性cDNA克隆及包装顺式元件的初步界定[A];首届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文摘要集[C];2002年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 王艳明;SARS冠状病毒抗体金标快速诊断试剂盒通过专家鉴定[N];医药经济报;2004年
2 ;我国成功解析SARS冠状病毒蛋白酶三维结构[N];新华每日电讯;2003年
3 罗政;中美合作研究SARS冠状病毒取得进展[N];中国医药报;2004年
4 杨霞 王攀;专家确认果子狸为SARS冠状病毒主要载体[N];医药经济报;2004年
5 杨霞;中国科学家成功解析SARS冠状病毒进化规律[N];人民日报;2004年
6 李玉花 王淑君;SARS冠状病毒全基因组基因克隆成功[N];健康报;2003年
7 李煦 李柯勇;我国研制出SARS冠状病毒全基因组芯片[N];新华每日电讯;2003年
8 黄显斌 周光德;我国SARS病理研究获得新进展[N];中国医药报;2004年
9 记者谢卫群;中国完成SARS病毒主要基因克隆和蛋白表达[N];人民日报海外版;2003年
10 田茹 马文生 付文飙 董敬民;九万里风鹏正举[N];中国国门时报;2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 韩剑峰;SARS-CoV BJ01株全长cDNA的构建及其S基因突变对病毒感染性的影响[D];中国人民解放军军事医学科学院;2006年
2 华荣虹;SARS冠状病毒S蛋白抗原表位分析与定位研究[D];中国农业科学院;2005年
3 徐东平;SARS冠状病毒的临床检测和基因变异分析研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2006年
4 刘珠果;表达SARS冠状病毒受体hACE2的SARS易感小鼠模型的建立[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年
5 车小燕;严重急性呼吸综合征(SARS)实验室诊断技术的基础与应用研究[D];第一军医大学;2005年
6 张原;SARS冠状病毒的分子进化研究[D];复旦大学;2007年
7 廖庆姣;丙型肝炎病毒核心蛋白和NS5A蛋白对NF-κB的激活研究[D];武汉大学;2005年
8 王瑞琳;SARS冠状病毒分离鉴定、疫苗构建及免疫血清制备研究[D];吉林大学;2006年
9 陈云新;ACE2基因变异与SARS冠状病毒进入及肺部病变严重程度之间的关系研究[D];中国协和医科大学;2008年
10 陈苏红;四种重要传染病病原体检测新技术研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张笋华;SARS冠状病毒主要蛋白酶3CL~(pro)的N-finger多肽是酶活性所必需[D];华东师范大学;2005年
2 彭宇;SARS冠状病毒N蛋白与病毒前导RNA相互作用的初步研究[D];武汉大学;2005年
3 李建娜;SARS-CoV主要结构蛋白的基因表达及DNA疫苗构建[D];华南热带农业大学;2005年
4 翁少洁;SARS冠状病毒3a蛋白通过与CAML分子结合而抑制细胞凋亡[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
5 费小战;SARS冠状病毒刺突蛋白S144-643的原核表达及其重要生物特性研究[D];华中农业大学;2005年
6 李玉斌;SARS小包膜蛋白表达、纯化及单克隆抗体的制备[D];吉林大学;2006年
7 赵慧;siRNA对SARS冠状病毒复制的抑制作用研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
8 商磊;SARS冠状病毒的基因组变异与进化研究[D];浙江大学;2005年
9 胡族琼;SARS冠状病毒Mc区的克隆表达及表达蛋白抗原活性研究[D];第一军医大学;2005年
10 刘杰;SARS冠状病毒非结构蛋白Nsp14基因的克隆表达及其作用底物的制备[D];山东农业大学;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026