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《中国人民解放军军事医学科学院》 2007年
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抗菌肽基因格拉利素的克隆及功能研究

杨超文  
【摘要】: 人Glyrichin基因(中文:人格拉利素,又称HL52)是在本室首次发现并注册的鼠Glyrichin基因(GenBank number:AY028425,又称mL52)的基础上,以22周人胎肝cDNA文库为模板扩增出的新基因。本研究是在鼠.Glyrichin的基础上,通过生物信息学和分子细胞生物学对人Glyrichin基因进行功能研究。 生物信息学分析显示人Glyrichin基因核苷酸长度为240bp,具有完整的开放阅读框架,编码79个氨基酸。电子PCR染色体定位提示人Glyrichin基因定位于染色体的20q11.22,基因组结构分析显示Glyrichin由两个外显子和一个内含子组成。蛋白序列同源性分析未发现有已知功能的同源蛋白,也未发现已知的功能域,是一个功能未知的蛋白,这对该基因功能的研究带来了一定的困难。但其理化特点如富含甘氨酸(21.5%),pI=9.58。在pH=7时带正电荷,是小分子碱性蛋白,二级结构使用DNAstar5.0软件分析为集亲水性与疏水性于一体,以β折叠为主,这与已知抗菌肽共有的结构特点相似。 本研究对人Glyrichin的天然存在性进行了探讨,以Northern杂交方法分析该基因在四种人源性肿瘤细胞中的表达及转录本大小,证实了人Glyrichin具有单一转录本,大小为600bp左右:以RT-PCR分析其在胎肝、胎肾、胎脾、胎肺等四种组织中的表达情况,以GFP为标记蛋白对基因的亚细胞定位进行探索,证实了该蛋白可能分布于胞浆。 生物信息学分析显示人Glyrichin理化性质具有了抗菌肽的诸多特点,我们合成了代表人Glyrichin功能的肽段pCM-19进行抗菌功能分析,证实了pCM-19良好的抗菌功能,然后利用原核表达系统,构建了含有格拉利素基因的系列缺失体的pET22b表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。观察到该基因诱导表达时对宿主菌菌体生长具有明显的抑制作用,初步证实了人Glyrichin具有明显的抗菌活性,同时也证实了蛋白C端对其抗菌活性的发挥是必须的。人Glyrichin完整蛋白原核表达也证实了具有良好的抗菌活性。 我们选用了毕赤酵母表达系统对该基因进行功能分析,将人Glyrichin基因构建到毕赤酵母表达载体pPIC9和pPIC9K中,锂盐法转化毕赤酵母GS115中,G418抗生素筛选高拷贝转化子,进行培养诱导,对表达上清通过“纸片法”、“试管法”、“琼脂糖纸片扩散法”验证表达产物的活性。证实了人Glyrichin具有抗菌活性。 通过生物信息学比较我们发现了有29个成员组成的高度同源的全新抗菌肽家系,通过代表家系九个成员的4个合成肽的抗菌活性检测和线虫源格拉利素基因原核表达分析,证实了它们具有良好的抗菌活性,强烈提示一个跨物种的抗菌肽家系的存在。 综上所述,本研究获得了人源性和线虫源的格拉利素基因,确认了其天然存在性,通过原核表达和毕赤酵母表达系统证实了其具有明显的抗菌活性。生物信息学分析及实验验证提示一个跨物种的有29个成员的新的抗菌肽家系的存在。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R346

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1 杨超文;抗菌肽基因格拉利素的克隆及功能研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2007年
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