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《中国人民解放军军事医学科学院》 2007年
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大黄及其主要成份的毒性毒理研究

王青秀  
【摘要】: 大黄为我国四大最常用的中药之一,全国8000多种中药制剂中约有800多种含有大黄,是治疗多种疾病的重要中药,被称为中药“四大金刚”之一,在临床上有着广泛的应用。大黄药理有效成分主要为蒽醌类化合物,包括大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚等。以往研究发现大黄可能具有肝肾毒性和致癌的潜力,但是对大黄中主要成份的毒性比较研究及毒性机制研究报道甚少,目前尚没有明确的定论。本课题采用体内、体外多种实验方法研究和探讨了大黄毒性反应的作用靶器官,大黄中主要成份的毒性比较研究,在此基础上利用代谢组学技术,探讨了大黄素等蒽醌的毒理学作用机制,初步证明了大黄毒性的客观真实性,为大黄的临床安全应用提供了参考依据。 研究发现大黄重复给药6个月产生毒性反应的剂量为10g/kg/d,无明显毒性反应的剂量为2.5g/kg/d(相当于临床常用剂量10g的15倍,换算成人的等效剂量约为0.4g/kg/d),对SD大鼠的主要毒性表现为动物排稀便、软便、体重增长抑制,被毛脏乱、红染,精神不振等,血液生化检查发现BUN略有升高,病理检查发现大黄引起大鼠肾小管上皮细胞内色素沉积和水样变性、肝细胞轻度萎缩、肠粘膜轻度增厚。毒性反应主要靶器官为肾脏,毒性部位为肾小管上皮细胞,肝脏也可能是其毒性靶器官之一,上述毒性损害均可逆。 大黄中几种主要成份体外毒性比较试验发现,大黄素等对HK-2细胞增殖抑制的IC_(50)值分别为:大黄酸82.97μM,大黄素甲醚76.02μM,大黄素130.65μM,其毒性大小顺序为:大黄素甲醚>大黄酸>大黄素>芦荟大黄素>大黄酚;对于HepG2细胞的其IC_(50)值分别为:大黄酸67.71μM,大黄素125.30μM,毒性大小顺序为:大黄酸>大黄素>芦荟大黄素>大黄酚和大黄素甲醚。大黄素等均能引起两种细胞增殖抑制,细胞萎缩和空泡化,LDH漏出率增加,线粒体膜电位降低,细胞出现明显的凋亡,大黄素使HK-2细胞周期阻滞在S期,而对HepG2细胞的周期没有明显的影响。Western印渍分析凋亡相关蛋白显示,大黄素和大黄酸处理HK-2细胞后,抑制细胞外信号调节激酶1/2(extracelluar signal regulated kinase 1/2,ERK1/2)的磷酸化,并且呈现明显的剂量和时间效应关系,细胞内Bcl-2表达降低,Bax没有明显的变化,致使促凋亡基因蛋白占优势,细胞向促调亡的方向发展,细胞色素c释放增加,从而使Caspase-8活化,激活下游caspase3,引起细胞的凋亡;对HK-2细胞的损伤效应可能是通过MAPK/ERK信号转导通路抑制ERK磷酸化,而导致了细胞周期阻滞和凋亡。Ames波动试验结果表明大黄素在加有S_9时具有弱的致突变性,是间接遗传毒性物质,大黄酸和大黄酚没有致突变性;体内试验发现大黄素对CYP450尤其是CYP1A1具有一定的诱导作用,表明大黄素还可能具有潜在的促癌作用。大黄素是大黄中含量最高的蒽醌成份,因此大黄素可能是大黄主要的毒性作用物质之一。 利用NMR技术研究大黄素处理后大鼠尿液、血浆和肾脏组织萃取物中内源性代谢产物谱的变化,研究发现血浆中肌氨酸、异丁酸盐和3-羟基丁氨酸(3-HB)升高,而乳酸、胆碱/磷酸卵磷酯、葡萄糖和多种氨基酸及VLDL/LDL等明显下降;尿液中肌酐、TMAO、醋酸盐、乳酸、葡萄糖和各种氨基酸明显升高,而柠檬酸盐、马尿酸和2-酮戊二酸含量下降,尿液中葡萄糖和氨基酸升高是肾小管损伤的典型标志;肾组织萃取物中醋酸盐、3-HB和肌酐明显增加,而乳酸和胆碱/磷酸卵磷脂下降;脂溶性成分中甘油三脂和细胞膜组成成份等脂类的比例发生改变;由此可以推测大黄素可能是通过改变脂类代谢,导致脂类成分的改变,破坏细胞膜性结构,致使肾小管上皮细胞受损而造成重吸收障碍。尿液中的氨基酸、葡萄糖、TMAO以及肌酐可以作为大黄素的主要生物标志物研究。 综上,大黄毒作用靶器官主要是肾脏,尤其是肾近曲小管上皮细胞,肝脏也可能是其毒性靶器官之一,大黄素是主要的毒性成分,损伤机制可能为大黄素通过MAPK/ERK信号转导通路抑制ERK磷酸化,肾脏脂类成分的改变,致使肾小管上皮细胞线粒体外膜受到损伤,细胞色素C从线粒体释放,进而引发细胞凋亡,导致肾小管重吸收障碍,从而形成氨基酸尿和葡萄糖尿,这种毒性作用是可逆的。 大黄的临床应用十分广泛,正常情况下使用大黄是安全的,但长期、大剂量使用会出现毒性反应,因此在临床上长期用药不要超过0.4g/kg/日,肝肾损伤患者应用时需要调整剂量,长期应用时要注意监测其肝肾功能。其他含蒽醌类药物如芦荟、决明子和虎杖等可能也有类似的毒性毒理机制,因此,应该建立质量标准,控制毒性成份的含量,加强对此类药物的不良反应监测。随着代谢组学技术的发展,此项新技术将会越来越多的用于其他中草药毒性毒理的研究,对于实现中药现代化具有重要的意义。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R285

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