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《中国人民解放军军事医学科学院》 2007年
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抗人红细胞单链抗体融合HIV-1gp41抗原肽双功能分子的制备与鉴定

邵长利  
【摘要】: 抗人红细胞抗体是一类针对人红细胞表面各种抗原的单克隆抗体。在抗人红细胞单克隆抗体中,IgG类抗体因其在盐水中能与红细胞结合但不使红细胞凝集,被称为抗人红细胞非凝集型单克隆抗体。近年研究证实,该类单克隆抗体无论是在疾病诊断还是临床治疗方面,都具有很大的潜力。目前,国内外已制备了许多非凝集型抗人红细胞单克隆抗体。实践证明,将抗人红细胞单克隆抗体改造成重组的单链抗体,将进一步拓展该类单抗的应用范围。 H血型抗原是Hh血型系统中唯一的抗原。除稀有的孟买(Bombay)型红细胞外,H抗原分布在所有人红细胞的表面。与红细胞表面其他特有抗原相比,H抗原属于共有抗原,在各型红细胞中分布广泛,应用价值较大。根据自体红细胞凝集试验原理建立的抗原、抗体检测方法是抗红细胞抗体在免疫诊断方面的应用之一。 自体红细胞凝集试验的基本原理是:取一滴被检者自身的全血,向其中加入一种双功能分子,这种双功能分子既可以结合全血中的红细胞,又可与待检的抗原或抗体结合,如果该血样中含有待检的抗体或抗原,那么,双功能分子将分别与红细胞和待检物结合,通过该双功能分子的桥联作用,将血中的红细胞连接到一起,从宏观上看,就会呈现肉眼可见的凝集现象,即为自体红细胞凝集试验。 本研究在已经制备了一株分泌抗人红细胞H抗原的杂交瘤细胞株2E8的基础上,建立了具有自主知识产权的自体全血凝集试验检测方法,可用于检测血液中是否有抗HIV-1gp41抗体的存在。 1抗体可变区基因的克隆 通过RT-PCR的方法,从分泌抗人红细胞H抗原的杂交瘤细胞株2E8中克隆了抗体重链可变区基因(V_H)和轻链可变区基因(V_L),基因大小分别为351bp和339bp。其中,VH属于鼠抗体可变区重链基因家族Ⅰ(B)亚群,V_L属于鼠抗体可变区轻链基因家族Ⅰ亚群。 2单链抗体蛋白的表达与鉴定 通过重叠引物延伸法(SOE)将克隆的抗体重链和轻链可变区基因拼接成抗人红细胞H抗原单链抗体基因,基因大小为750bp。将序列鉴定正确的单链抗体基因用BamHⅠ和NheⅠ酶从中间载体上酶切下来,与经同样酶切的pET-his载体连接,构建原核表达载体pET-his-scFv。 将含单链抗体基因的原核表达载体转化到BL21(DE3)plysS菌中,用IPTG诱导目的基因表达单链抗体蛋白。采用SDS-PAGE、Western blotting法鉴定单链抗体蛋白的表达,证实目的蛋白以包涵体的形式获得了大量表达,其分子量大小约32kDa。经ELISA、竞争ELISA、免疫荧光、凝集抑制等试验证实单链抗体蛋白具有与红细胞表面H抗原结合的活性。 3抗人红细胞单链抗体融合HIV-1gp41抗原肽基因的表达与鉴定 在成功亚克隆单链抗体基因的基础上,将2E8 C_H1基因和HIV-1gp41抗原肽基因顺次连接到单链抗体基因的C端,亚克隆抗人红细胞单链抗体融合HIV-1gp41抗原肽基因,基因大小为1150bp。将序列正确的抗人红细胞单链抗体融合HIV-1gp41抗原肽基因从中间载体上酶切下来,与经同样酶切的pET-his载体连接,构建原核表达载体pET-his-scFv-C_H1-gp41。 将构建的含抗人红细胞单链抗体融合HIV-1gp41抗原肽基因的原核表达载体转化到BL21(DE3)plysS菌中,用IPTG诱导目的基因表达融合蛋白。采用SDS-PAGE、Western blotting法鉴定融合蛋白的表达,证实目的蛋白以包涵体的形式获得了大量表达,其分子量大小约45kDa。经ELISA、竞争ELISA、免疫荧光、凝集抑制等试验证实融合蛋白具有与红细胞表面H抗原结合的活性。 4基于融合蛋白的全血免疫检测系统模拟检测 采用正常O型红细胞、已经确认的含HIV-1gp41抗体血浆、上述表达产物等模拟全血免疫检测系统。结果表明30份经WB确证的阳性HIV血浆均可产生红细胞凝集反应,符合率为100%,其中强凝集样本22份,弱凝集样本8份。用A、B、AB三种血型红细胞分别与6份经WB确证的阳性HIV血浆组成全血与双功能分子融合蛋白作用后,均产生了凝集反应。取30份O型HIV抗体阴性全血与融合蛋白作用,均未产生凝集。 5结论 通过以上结果得知,以抗人红细胞H抗原2E8单抗为基础,制备抗人红细胞单链抗体融合HIV-1 gp41抗原肽的双功能分子,能够用于检测血液中抗HIV-1gp41抗体的存在。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R392

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