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《中国人民解放军军事医学科学院》 2007年
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激活NNMR中药配伍对动脉粥样硬化独立危险因素所致血管内皮细胞损伤的保护作用

陈凯  
【摘要】: 动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是严重危害人类健康的常见病与多发病,欧美国家疾病致死原因的50%以上与AS密切相关,我国近年来AS的发病率也呈现逐年上升和年轻化的趋势。但是迄今为止,国际范围上尚无以AS为临床适应症的药物上市,因此,寻找新作用机制、有效、安全的抗AS药物,具有重要意义。 AS是一种慢性炎症增殖性疾病,内皮细胞功能紊乱是AS发生发展的的早期环节。因此靶向内皮细胞,纠正其功能紊乱,可有效对抗AS的形成。AS独立危险因素存在下,血管内皮细胞非神经性M受体(non-neuronal muscarinic receptor,NNMR)功能低下,内皮NNMR功能异常是AS的最早期的始动环节。本室前期研究表明,在高血脂致内皮NNMR功能已经低下的前提下,采用特异性拮抗剂进一步降低其功能,可加重AS病变;而采用NNMR激动剂改善内皮功能,则可有效对抗AS进展。因此,靶向内皮NNMR,改善其异常功能,是抗AS的早期防治策略。基于本室工作基础和国内外文献报道,本研究在明确激活NNMR抗AS作用的基础上,选用另外两味临床报道具有不同抗AS作用机制的活血化瘀药单体,进行抗AS药物组方研究,旨在发现既可激活内源性保护机制又可针对外在致AS损伤因素产生内皮保护作用的抗AS中药复方,并命名为EPD,三味中药单体代号分别为A、B、C。本室已经在ox-LDL致内皮细胞AS样损伤模型上,采用均匀设计,观察了该复方中A、B、C三药三因素六水平联合作用对内皮细胞损伤后ICAM-1基因表达的影响,经数理统计分析发现三药之间存在交互作用,且三药中A药为主药,联用时A药不可缺,联合使用比例为1∶40∶30时药效最佳;进一步在细胞水平上,采用两种主要的AS危险因素(高糖、高同型半胱氨酸)致内皮细胞损伤模型,研究EPD的抗AS作用,发现EPD在2、6、10μmol/L浓度下,可显著抑制高糖、高同型半胱氨酸诱导的ICAM-1、VCAM-1、MCP-1基因过度表达,产生内皮保护作用。 本研究在前期工作基础上,首先在尿酸致血管内皮细胞损伤模型上,评价EPD的内皮保护作用,并对EPD与其主药槟榔碱的药效进行对比研究,同时观察NNMR拮抗剂阿托品对EPD的拮抗作用,分析EPD的作用靶标。其次在AS的另一独立危险因素ox-LDL致血管内皮细胞损伤模型上,进行拓展性研究,系统评价EPD对AS不同独立危险因素的内皮保护作用。进一步采用高脂饮食诱发ApoE~(-/-)小鼠AS形成,对EPD的抗AS药效学进行验证,为EPD发展为抗AS药物候选复方提供实验依据。 一.EPD对尿酸所致血管内皮细胞损伤的保护作用 1.抑制粘附分子ICAM-1、VCAM-1和趋化因子MCP-1的过度表达 EPD在10~(-8)~10~(-4) mol/L浓度范围内可剂量依赖性抑制尿酸诱导的粘附分子ICAM-1、VCAM-1和趋化因子MCP-1的过度表达,其效应强于主药槟榔碱,NNMR拮抗剂阿托品可阻断EPD的作用。 2.促进NO的释放 EPD在10~(-8)~10~(-4)mol/L浓度范围内可剂量依赖性地升高尿酸损伤的大鼠主动脉内皮细胞培养液中NO含量,其效应强于主药槟榔碱,NNMR拮抗剂阿托品可阻断EPD的作用。 结论:以槟榔碱为主药的中药配伍EPD具有强效抗尿酸损伤效应,介导内皮细胞保护作用,其抗动脉粥样硬化样损伤作用与激活NNMR相关。 二.EPD对ox-LDL所致血管内皮细胞损伤的保护作用 1.抑制单核—内皮细胞粘附和迁移 EPD在10~(-8)~10~(-4)mol/L浓度范围内可剂量依赖性抑制ox-LDL诱发的U937单核细胞对ECV304细胞的迁移和粘附,其效应优于主药槟榔碱,NNMR拈抗剂阿托品和NOS抑制剂L-NAME均可阻断EPD的作用。 2.抑制粘附分子ICAM-1、VCAM-1和趋化因子MCP-1的过度表达 EPD在10~(-7)~10~(-5)mol/L浓度范围内可剂量依赖性抑制ox-LDL诱导的粘附分子ICAM-1、VCAM-1和趋化因子MCP-1的过度表达,NNMR拮抗剂阿托品可阻断EPD的作用。 3.促进NO的释放 EPD在10~(-7)~10~(-5)mol/L浓度范围内可剂量依赖性地升高ox-LDL损伤的内皮细胞培养液中NO含量,NNMR拮抗剂阿托品可阻断EPD的作用。 结论:以槟榔碱为主药的中药配伍EPD具有强效抗ox-LDL损伤效应,介导内皮细胞保护作用,其抗动脉粥样硬化样损伤作用与激活NNMR、增进NO系统生物学效应相关。 三.EPD对高脂饮食诱发ApoE~(-/-)小鼠AS的影响及其分子机理 1.对抗ApoE~(-/-)小鼠AS的形成 ApoE~(-/-)小鼠高胆固醇饲养7周,可形成明显的AS病变,同时给予EPD10mg/kg/日治疗后,AS病变显著减轻,斑块面积及斑块面积占整个管腔面积的比值较模型组分别降低了71%和73%。EPD还可逆转内皮细胞形态学损伤,但不影响血清TC含量,提示其抗AS作用与调血脂无关。 2.抑制高脂饮食ApoE~(-/-)小鼠炎性免疫反应 2.1降低斑块处T细胞浸润和粘附分子的过度表达,抑制炎性免疫反应 EPD可使主动脉根部AS斑块处T淋巴细胞浸润降低55%,并可显著降低主动脉血管壁粘附分子ICAM-1、VCAM-1、VLA-4和趋化因子MCP-1的过度表达。 2.2抑制T淋巴细胞增殖,调控Th1/Th2平衡 EPD 10mg/kg可显著降低ConA诱发的脾脏T淋巴细胞增殖反应,T淋巴细胞增殖率较模型组降低了68%;可显著降低脾脏和主动脉血管壁IFNγ和脾脏IL-12的过度表达,升高主动脉血管壁IL-10的过度表达,调节Th1/Th2免疫平衡。 3.促进NNMR和PPARγ的表达,抑制NF-κB的表达 EPD 10mg/kg可促进NNMR和PPARγ的表达,抑制NF-κB的表达。提示,其抗AS作用与激活NNMR密切相关,并通过与之偶联的核转录因子NF-κB和PPARγ发挥作用。 结论:EPD 10mg/kg可对抗高血脂诱发的ApoE~(-/-)小鼠AS的形成;降低主动脉斑块处T淋巴细胞浸润和粘附分子表达,抑制病变部位的炎性免疫反应;抑制T淋巴细胞的增殖和促炎的Th1因子INFγ、IL-12的表达,促进抗炎的Th2因子IL-10的表达,调控Th1/Th2的平衡。 综上所述,槟榔碱在尿酸、ox-LDL两种致AS危险因素下,可剂量依赖性地降低单核—内皮细胞迁移和粘附,抑制粘附分子的过度表达,促进NO的释放而发挥内皮保护作用,以槟榔碱为主药的中药配伍EPD内皮保护作用显著增强,其抗动脉粥样硬化样损伤作用与激活NNMR相关。在高脂饮食诱发的ApoE~(-/-)小鼠AS形成模型上,进一步验证了细胞实验的结果,EPD可对抗AS的形成,保护内皮,抑制炎性免疫反应。以槟榔碱为主药的中药配伍EPD通过激活NNMR产生内皮保护作用,介导抗AS作用,优于单药槟榔碱的药效,具有进一步发展和研究的前景。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R285

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