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《中国人民解放军军事医学科学院》 2006年
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p21~(WAF1/Cip1)远端启动子及自反馈转录调节研究

瞿文全  
【摘要】: p21~(WAF1/Cip1)是第一个在哺乳动物细胞被发现的CDK(cyclin dependentkinase)抑制因子和肿瘤抑制基因p53的转录靶。已有的研究证明,p21在细胞增殖、分化、死亡和细胞衰老中有着重要功能意义。p21作为细胞周期检查点关键蛋白分子参与了细胞周期G1和G2/M期阻滞;DNA修复以及细胞凋亡调控。尽管如此,令人不解的是,迄今为止对多种肿瘤组织和近百种细胞的进一步筛查研究,很少检测出p21编码区的突变或其等位基因的缺失。也未能真正证明肿瘤细胞有异常的p21启动子区的DNA甲基化。然而,事实上p21确实在肿瘤发生发展的进程中发挥着重要的功能作用。目前有关p21基因在转录水平上的调控研究主要集中在对启动子转录起始点至上游2.5kb之间区段,在距起点2.5kb外的上游启动子区的调控缺乏深入研究。此外,研究揭示:p21也可以作为转录辅因子与其它蛋白如E2F1、C/EBPα、c-Myc、STST3以及CBP/p300等相互作用并调节其功能。对p21过表达后的全基因表达谱分析发现,外源表达p21似乎促进了内源p21的表达,但其结论尚不明确。有鉴于p21在肿瘤生成中这些令人困惑和模糊的功能以及p21转录研究的现状,进一步深入探讨p21转录调节及功能意义实有必要。据此,本文对外源p21蛋白促进内源p21表达进行了验证,进一步在转录水平上对其调节机理以及存在的生物学意义进行了探讨,并对p21基因启动子以及蛋白修饰进行了一些研究。研究内容及进展主要在如下三个方面: 一、对p21基因启动子生物信息学分析,我们发现在距启动子转录起始位点上游-2.6~-3.3kb区域有一段具有反向重复结构的序列,该区域包含Alu家族重复序列。缺失实验表明该段序列具有较强的转录抑制活性;分段检测发现该序列的抑制活性与其反向重复形成的特殊二级结构有关;其单独上、下游臂区域及中间区三个部分都有一定的抑制活性,似乎表明该区域可能还存在与转录因子结合的抑制性顺式结合元件。与不同转录因子共转染,发现该区域对p21基因的转录因子激活活性具有广泛的抑制作用,并且实验证明这种抑制作用在多种细胞中存在。凝胶阻滞实验分析,发现该区域存在蛋白结合活性,其中间区域结合信号最强。生物信息学分析中间区域元件并实验验证,在其中鉴定了三个紧密靠近的元件包括2个Sp1元件、1个C/EBPα元件,同时在其下游臂区发现了1个C/EBPβ元件。以上结果表明,在p21基因启动子上游2.5kb以外区域还存在多个重要的转录调控区域;除了激活性元件外,p21基因还包含有抑制性转录元件。 二、通过外源转染HA-p21融合蛋白表达质粒,我们证实外源p21确实能够促进内源p21表达。以p21基冈表达质粒与p21启动子荧光素酶报告载体共转染,证实促进作用是在转录水平实现并且不依赖于p53。启动子逐段缺失分析,发现在近端0~-180bp及远端的反向重复区二个区域存在p21反应元件。分析近端区域,证实Sp1及CBP参与了p21在近端区的促进,CBP的组蛋白乙酰基转移酶活性起着非常关键的作用。进一步分析远端区域,结果表明远端Sp1及C/EBPα元件参与了p21在远端区的转录增强。染色质免疫共沉淀实验分析蛋白因子在不同的时间点在p21启动子二个区域的结合,结果表明:p21、Sp1及CBP先结合到近端启动子DNA上增强自身基因转录,然后p21、Sp1、C/EBPα以及CBP再转定位到远端区;这些蛋白因子在二个区域的结合只存在于p21表达的早期;TSA处理后蛋白因子在启动子上结合情况与外源转染后的结果基本一致。然后用蛋白免疫共沉淀实验及二次染色质免疫共沉淀实验,证实p21、p53、Sp1以及CBP等蛋白因子存在于同一个复合体并结合在p21启动子近端及远端二个区域。以上结果表明:在外源转染p21表达质粒以及细胞受到TSA损伤应激后p21表达的早期阶段,p21蛋白能够作为转录因子辅因子,通过一个反馈环调节机制促进自身基因转录。 进一步对该调节途径存在的广泛性以及生物学意义进行分析。实验表明,外源p21蛋白能在多个不同的细胞系中反馈增强p21启动子活性以及促进内源p21蛋白表达;用TSA及顺铂处理HeLa细胞以及TSA处理HepG2细胞后也都检测到了p21蛋白与近端以及远端启动子序列的结合。这表明,p21的自身反馈环调节在细胞中可能是一个普遍存在的现象。转染外源p21基因短时间表达后再加入TSA处理,用流式细胞术分析p21蛋白对TSA处理后细胞周期的影响。结果表明,p21蛋白促进了细胞损伤应激下产生的损伤细胞的凋亡及部分修复,使细胞周期时相分布维持在正常状态,从而在细胞群整体水平上保护细胞。 以上结果表明,在细胞受到损伤等细胞应激刺激后的早期阶段,p21基因转录存在一个应激保护性自反馈环调节机制。 三、在细胞中过表达p21蛋白后,我们的研究揭示,p21蛋白受到包括泛素化、磷酸化以及乙酰化等多种修饰。其中乙酰化修饰可能在表达的早期占据主要地位。使用药物特异性抑制CBP的乙酰转移酶(HAT)活性,结果表明p21的乙酰化修饰与CBP的HAT活性有关。这种稳定性修饰可能与p21蛋白的早期反馈增强调节具有功能上的一致性。这些结果也表明,细胞中p21蛋白同时受到多种修饰,在不同的生理状态下,不同的修饰形式占据主导地位。 以上研究揭示,在p21基因诱导、表达,以及在转录及转录后水平上的调控存在更为复杂的机制。我们的研究工作有助于深入理解p21基因转录调控机理,蛋白合成后的修饰及功能意义,对于理解p21在肿瘤发生中的功能作用也有启示。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:Q343

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