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《中国人民解放军军事医学科学院》 2008年
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SPK1-S1P信号调节血液肿瘤细胞凋亡的作用及机制研究

李庆芳  
【摘要】: 骨髓造血微环境分泌的各种细胞因子以及血液肿瘤细胞本身的痛基因是决定血液肿瘤细胞增殖、分化、凋亡及耐药的主要因素。因此,探讨细胞因子以及癌基因信号通路中的信号分子可能为血液肿瘤的治疗提供新的靶点。细胞膜鞘磷脂衍生物神经酰胺(Cer)、鞘氨醇(Sp)及1-磷酸鞘氨醇(SlP)在调控细胞增殖、存活及凋亡中发挥着重要作用。鞘氨醇激酶(SPK)是调控细胞内Cer、Sp、SlP代谢平衡的关键酶。SPKl磷酸化Sp生成SlP,SlP通过细胞内外作用机制调节细胞生长和凋亡。我们利用慢性粒细胞白血病(CML)和多发性骨髓瘤(MM)细胞为模型,研究了SPKl-SlP信号对上述恶性血液肿瘤细胞凋亡的调节作用及机制。 CML是一种以髓系细胞受累为主的多能造血干细胞的克隆性疾病。目前认为CML的主要分子发病基础为:位于9q34的abl基因与位于22q11的bcr基因相互易位形成bcr/abl融合基因,并编码具有很强蛋白酪氨酸激酶活性的P210~(bcr/abl)。融合蛋白,该蛋白通过多种信号通路抑制细胞凋亡而导致细胞转化。BCR/ABL可以上调抗凋亡蛋白Mcl-1的表达,但关于BCR/ABL诱导的Mcl-1表达上调机制目前并不很清楚。 为阐明SPKl信号在BCR/ABL信号通路中的作用。首先,构建和制备了携带bcr/abl基因的逆转录病毒,分别感染NIH-3T3、BaF3和HL-60细胞,G418筛选得到稳定表达bcr/abl的上述细胞系,利用RT-PCR证实bcr/abl基因的表达。Western blot检测高表达bcr/abl的NIH-3T3、BaF3和HL-60细胞其SPKl的表达,并且用[γ-~(32)P]掺入法榆测SPK激酶活性。分别用BCR-ABL、MAPK、PI3K和Jak-STAT3信号通路阻断剂STI571、PD98059、Wortmannin和AG490处理BaF3/BCR-ABL、BaF3/pLXSN和K562细胞,然后收集细胞,用[γ-~(32)P]掺入法和Western blot检测SPK活性和表达。为阻断CML细胞SPKl的表达和活性,构建和制备了携带SPKl特异干涉序列的重组腺病毒。通过流式细胞仪检测AnnexinV和PI双标的细胞,确定细胞凋亡情况。研究结果表明BCR/ABL能够通过多条信号通路,包括MAPK、PI3K和JAK2上调CML细胞SPK表达和活性。逆转录病毒介导的bcr-abl基因在NIH-3T3、BaF3和HL-60细胞的高表达能够上调SPKl的表达和活性,并且BCR-ABL、MAPK、PI3K和Jak-STAT3信号通路特异阻断剂能够抑制BCR/ABL诱导的SPKl表达和活性上调。另外,BCR/ABL能够诱导CML细胞Mcl-1的上调。用SPKI特异阻断剂DMS以及携带SPKl特异干涉序列的腺病毒感染CML细胞能够降低Mcl-1表达。BCR/ABL诱导的SPKl表达和活性的上调导致Mcl-l表达上调,干涉SPKl增加STI571诱导的CML细胞凋亡。该研究证实了SPK参与BCR/ABL信号调节并介导其上调Mcl-1表达的作用。 MM细胞的增殖及凋亡受细胞因子及骨髓微环境的调节。骨髓瘤细胞本身以及骨髓微环境可以分泌多种细胞因子,尤以IL-6的过度产生与MM的关系最为密切。这些细胞因子通过白分泌或旁分泌的方式对多发性骨髓瘤细胞的增殖、凋亡以及耐药特性发生影响,这其中涉及到多种信号途径,包括JAK-Stat、PI3K、MAPK、Rho、FAK等。除此之外,是否还有其它的信号转导途径参与? 我们的研究结果表明多发性骨髓瘤原代细胞和细胞系表达SPK及SlP受体,这提示MM细胞可能受到SPKl-SlP信号的调控。MM细胞本身以及骨髓微环境可以分泌多种细胞因子,尤以IL-6的过度产生与MM的关系最为密切。我们发现IL-6能够提高MM细胞内SPK活性,并且具有量效关系。MAPK、PI-3K和JAK-STAT等多条信号通路参与IL-6对SPK的激活作用。激活SPK能够抑制DEX诱导的MM细胞凋亡,抑制SPK的活性促进MM细胞凋亡。IL-6对MM细胞凋亡的抑制作用主要通过上调Mcl-1分子。我们发现高表达SPK的细胞其Mcl-1表达水平较对照细胞高;当阻断SPK后,细胞Mcl-1的表达降低,而IL-6对Mcl-1的上调作用也受到抑制。另外,外源SlP可以抑制地塞米松诱导的MM细胞凋亡;SlP通过MM细胞膜表面的EDGs受体激活MAPK和JAK-Stat信号通路,从而上调Mcl-1的表达,发挥其抗凋亡的作用。这些结果表明SPKl-SlP参与调节细胞因子对骨髓瘤细胞凋亡的抑制作用。 综上所述,我们的研究结果表明SPKl-SlP信号分子调节CML、MM等恶性血液肿瘤细胞的凋亡,将为恶性血液肿瘤治疗提供新的靶点。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R733

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【参考文献】
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