收藏本站
《中国人民解放军军事医学科学院》 2009年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因的克隆与功能研究

张蕾  
【摘要】: 丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的根作为传统的活血化瘀药,具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等功效,近来研究还发现其在治疗心血管疾病方面疗效显著。其有效化学成分主要包括:水溶性多聚酚酸类化合物和以丹参酮类化合物为代表的脂溶性化合物。由于具有天然的抗氧化作用、抗动脉粥样硬化、降低心肌耗氧量等心血管药理作用、抗菌消炎作用和明显的抗肿瘤作用,这味传统的药材受到了国内外市场的追捧。然而目前野生丹参资源由于过度采收已遭破坏,栽培品种品质退化,质量参差不齐,因此要从根本上解决当前丹参栽培中面临的问题和丹参的质量控制,直接大规模工业化生产丹参的活性成分,更好地利用这一资源,必须阐明此类物质的生物合成途径。虽然已知丹参酮类化合物为二萜生源,同植物中其它二萜类物质一样,它们也是由类异戊二烯代谢途径产生,前体物质是牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP),但关于GGPP以后的具体过程却仍不清楚。GGPP是由GGPP合酶催化异戊烯基焦磷酸( isoprenyl pyrophosphate, IPP)和倍半萜前体法呢基焦磷酸( farnesyl pyrophosphate,FPP,C15)缩合形成的,它是二萜化合物的通用前体,为多种二萜、类胡萝卜素、叶绿素、醌和维生素E侧链等的提供构建骨架。由于GGPP是多种初生和次生代谢物的共同前体,因此,GGPP合酶能够起到调节碳流的作用,从而成为初生和次生代谢途径中的关键酶之一。 GGPP合酶普遍存在于植物、动物和细菌中,具有很高的保守性,在进化关系上具有明显的种族特异性,动物、植物、细菌、真菌和古细菌来源的GGPS蛋白序列在进化上属于不同的分支。对模式植物拟南芥GGPS的研究表明,在植物体内存在多个GGPS基因,不同酶型的GGPS在细胞中的定位不同,它们的表达亦具有时空特异性,其在代谢途径中的作用亦不同。已经知道的以GGPP为前体的具有药用价值的化合物有紫杉醇、银杏酚等,且已证明GGPS是决定红豆杉植物合成紫杉醇类物质的关键酶之一。 利用GGPS中两个富含天冬氨酸的保守区域FARM(the first aspartate-rich motif,II区)和SARM(the second aspartate-rich motif,V区)设计简并引物,通过同源扩增的方法获得400bp左右的与已报道其它植物中的GGPP合酶序列相似的核心序列,再用cDNA末端快速扩增技术(RACE)得到3’端和5’端序列,拼接三段序列,最终获得两条长度分别为1 298bp和1 177bp的丹参GGPScDNA序列,将其命名为SmGGPS1和SmGGPS2。生物信息学分析表明,它们分别具有1 095bp和1035bp的ORF框,与已报道的多个植物GGPS基因具有60%以上的一致性;推断其编码364个和344个氨基酸序列,分子质量分别为38 986.6和37 373.4,等电点分别为6.29和6.78,均具有多聚异戊二烯基合成酶的特异序列;TargetP 1.1在线分析它们的N端可能分别具有52个氨基酸和19个氨基酸的信号肽序列,引导这两个蛋白依次定位于质体和线粒体。RT-PCR半定量分析表明,这两个基因在所分析的各组织中均有表达,但SmGGPS1在成熟期(花期)叶片中的表达最强,而SmGGPS2则在成熟期的根和成花中表达最强;基因结构分析表明SmGGPS1基因有一397bp的内含子,而SmGGPS2则不带内含子。通过Gateway技术构建酵母表达载体,将其转化至GGPS缺陷的低温敏感型酵母菌株SFNY368,利用功能互补的原理,确证了SmGGPS1编码蛋白的确具有GGPP合酶;而SmGGPS2却不能很好的回复SFNY368的低温生长能力,分析可能是其信号肽序列的定位功能影响到该基因在酵母中的表达,需要进一步去除信号肽序列再确证其功能。 针对经过生化功能确定的SmGGPS1基因,分别构建了RNAi载体、过表达载体及两个相关的阴性对照空载体。利用SmGGPS1-RNAi载体,首次建立了发根农杆菌ACCC10060介导的外源基因转化丹参的体系,所得转基因毛状根具有抗生素和GFP双筛选标记,平均诱导率和转化率均可达50%以上。用同样的转化方法分别获得SmGGPS1过表达载体及其空载体对照转基因毛状根,分别选择20株过表达株系和17株空载体对照株系进行液体培养,45天后用代谢组学提取方法提取化合物,通过高效液相色谱(HPLC)检测分析,结果表明,过表达株系和空载体对照株系中含有丹参酮IIA的株系分别占90%和100%,含有丹参酮I的均为35%,而含有隐丹参酮的株系则分别占20%和71%;三种丹参酮类化合物的总量在空载体对照株系中基本呈正态分布,而过表达株系中除了15#特别多外,其余样本含量均不显著;这说明SmGGPS1的过表达导致了隐丹参酮含量的显著降低,进而引起了丹参酮类化合物总量的减少;选取19个由HPLC检测得到的化合物,对其进行主成分分析,结果显示过表达株系和空载体对照株系完全可以从化合物的角度被分开,说明过表达组的化合物检测结果并不是随机事件,而是SmGGPS1基因表达水平改变后的整体特征;同时找到了5个可作为代谢标识物的物质;聚类分析将这19个化合物分成了三类,其中两类可能与丹参酮类化合物的合成相关。利用根癌农杆菌介导转化分别得到了32株SmGGPS1-RNAi2、10株SmGGPS1-RNAi3和41株pDONR(-)转基因植株,其中有8株RNAi2植株和1株RNAi3植株肉眼可见的显著表型为根缩短、叶发黄,这提示赤霉素含量的升高及叶绿素和/或类胡萝卜素含量的降低。 结论:首次获得了两个丹参GGPP合酶基因,并通过酵母互补实验确证了SmGGPS1的生化功能;首次建立了发根农杆菌介导外源载体转化丹参的体系;通过分析过表达转基因毛状根中化合物的变化和RNAi转基因植株的表型,将这两个结果相联系,可以推测SmGGPS1在丹参中的主要作用之一是合成叶绿素和/或类胡萝卜素,而不参与赤霉素和丹参酮类物质的合成;但同时结果亦指示,在GGPP之后,赤霉素和丹参酮类物质在生物合成途径中可能有一段共同的合成步骤,而后才进入各自的特异分支途径中。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S567.53

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 马翠兰;吴杰;;仿野生中药材种植初探[J];光明中医;2011年09期
2 庞明;李西柳;陆刚;任姗;王俊儒;;丹参须根乙醇提取物抗氧化及抑真菌活性研究[J];西北林学院学报;2011年04期
3 贺学礼;李君;孟静静;赵丽莉;;摩西球囊霉和施P量对丹参生长和养分含量的影响[J];河北大学学报(自然科学版);2011年04期
4 杨芳;张宗申;杨斌;;过氧化氢对丹参悬浮细胞生长及次生代谢物积累的影响[J];西南农业学报;2011年03期
5 王文宝;南极星;;银屑灵薄膜衣片质量标准研究[J];安徽农业科学;2011年16期
6 ;[J];;年期
7 ;[J];;年期
8 ;[J];;年期
9 ;[J];;年期
10 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 孙建方;关杨;;丹参酮的药效学研究进展及其在皮肤科的临床应用[A];华东六省一市第八次皮肤性病学术会议论文汇编[C];2007年
2 陈卫银;王会民;金硕果;黄梅;朱观祥;刘福友;祝彼得;;丹参酮ⅡA预处理诱导脑缺血耐受及对TNF-amRNA表达的影响[A];中华医学会第十三次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2010年
3 李欣;张蓉;林治荣;余彦;杜俊蓉;;丹参酮抑制血管平滑肌异常增殖的实验研究[A];中国药理学会第八次全国代表大会暨全国药理学术会议论文摘要汇编[C];2002年
4 李平;;丹参酮佐治过敏性紫癜疗效观察[A];全国中西医结合变态反应第二次学术会议暨中国中西医结合学会变态反应专业委员会成立大会论文汇编[C];2004年
5 秦英;杨君;于海;张冬梅;牛福玲;王硕仁;朱陵群;周春华;;丹参酮Ⅱ_A对大鼠肾小球系膜细胞转染TGF-β1启动子活性的影响[A];中华中医药学会第二十一届全国中医肾病学术会议论文汇编(上)[C];2008年
6 段海波;杨赟金;丁中涛;曹秋娥;;丹参中三种丹参酮的区带毛细管电泳分析[A];中国化学会第十五届全国有机分析及生物分析学术研讨会论文集[C];2009年
7 曾慧明;戴永江;邓斌;;寻常性痤疮患者皮肤hBD-2的表达及丹参酮对其的影响[A];中华医学会第十五次全国皮肤性病学术会议论文集[C];2009年
8 孟宏;;复方丹参酮祛痘胶配合针刺、刺血拔罐治疗寻常性痤疮疗效观察[A];2008年中华中医药学会中医美容分会学术年会论文集[C];2008年
9 陈海亭;赵晔;巴东霞;吕媛玲;;丹参酮联合氢乳膏治疗异位性皮炎疗效观察(文摘)[A];首届全国中西医结合变态反应学术会议论文汇编[C];2002年
10 李欣;张蓉;林治荣;余彦;杜俊蓉;;丹参酮抑制血管平滑肌异常增殖的实验研究[A];中国药理学会第八次全国代表大会论文摘要集(第二部分)[C];2002年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 樊丽荣;口服丹参酮结合拔罐治疗急性扁桃体炎[N];农村医药报(汉);2008年
2 常怡勇;不宜与丹参合用的西药[N];上海中医药报;2002年
3 常怡勇;不宜与丹参合用的西药[N];中国医药报;2001年
4 通讯员 刘滨;“现代中药抗生素”引起广泛关注[N];科技日报;2004年
5 记者 冯建伟 通讯员 李志杰;巨额投资奔着方城农业来[N];农民日报;2004年
6 常 宇;生物技术给中药资源带来的好处[N];中国中医药报;2002年
7 郭永良 王目军 任伟;影响家种丹参市价的几大因素[N];中国中医药报;2002年
8 吴留;食物、药物大冲撞[N];人民政协报;2003年
9 本报记者 常 宇;栽培药材不比野生差[N];中国中医药报;2002年
10 周向东;同属冠心病用药 四大差别要清楚[N];医药经济报;2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张蕾;丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因的克隆与功能研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2009年
2 陈坚;MnSOD基因转染及丹参酮对胃癌细胞生长的影响及其分子机制[D];复旦大学;2003年
3 李钦;中药超分子技术研究[D];辽宁中医学院;2005年
4 周喆;复方丹参方活性单体对TNF-α损伤人血管内皮细胞的保护作用[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
5 晏琼;提高丹参毛状根生产丹参酮的诱导和过程策略研究[D];天津大学;2005年
6 王照华;丹参酮对肥厚心肌中电生理异常的干预[D];华中科技大学;2006年
7 屠恩远;丹参酮ⅡA对肥厚心肌信号转导系统蛋白激酶B通路的影响[D];华中科技大学;2009年
8 苏艳丽;高速离心剪切超细技术制备纳米丹参的工艺及药理研究[D];武汉理工大学;2007年
9 宋振巧;丹参种质资源的遗传多样性研究[D];山东农业大学;2008年
10 周展超;治疗寻常痤疮的几种外用制剂的临床及实验室研究[D];中国协和医科大学;1995年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 严莉;丹参酮ⅡA对实验性肝损伤的保护作用及其机制探讨[D];中央民族大学;2009年
2 宋婕;丹参苯丙氨酸解氨酶基因(SmPAL1)的克隆及其功能初探[D];陕西师范大学;2007年
3 闻罗汉;复方丹红滴丸的药学研究[D];大连理工大学;2007年
4 陈巍;丹参及甘草组织培养的研究[D];天津大学;2005年
5 梁芳芳;整合素连接激酶在病毒性心肌炎小鼠发病中的作用及丹参酮对心肌纤维化治疗效果的研究[D];吉林大学;2008年
6 周喜洋;丹参在大鼠离体肝脏保存时对HO-1的mRNA和蛋白表达的作用[D];南昌大学;2008年
7 白如君;丹参对2型糖尿病大鼠血浆ET、TXA_2、PGI_2的影响及意义[D];湖北中医学院;2006年
8 顾娟;丹参中酚酸类物质的提取与纯化[D];成都理工大学;2006年
9 梁勇;丹参与其两种主要成分抗肿瘤的初步研究[D];山东中医药大学;2006年
10 马立娟;丹参药材指纹图谱及其水溶性成分的定量研究[D];天津大学;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026