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《中国人民解放军军事医学科学院》 2009年
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丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因的克隆与功能研究

张蕾  
【摘要】: 丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的根作为传统的活血化瘀药,具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等功效,近来研究还发现其在治疗心血管疾病方面疗效显著。其有效化学成分主要包括:水溶性多聚酚酸类化合物和以丹参酮类化合物为代表的脂溶性化合物。由于具有天然的抗氧化作用、抗动脉粥样硬化、降低心肌耗氧量等心血管药理作用、抗菌消炎作用和明显的抗肿瘤作用,这味传统的药材受到了国内外市场的追捧。然而目前野生丹参资源由于过度采收已遭破坏,栽培品种品质退化,质量参差不齐,因此要从根本上解决当前丹参栽培中面临的问题和丹参的质量控制,直接大规模工业化生产丹参的活性成分,更好地利用这一资源,必须阐明此类物质的生物合成途径。虽然已知丹参酮类化合物为二萜生源,同植物中其它二萜类物质一样,它们也是由类异戊二烯代谢途径产生,前体物质是牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP),但关于GGPP以后的具体过程却仍不清楚。GGPP是由GGPP合酶催化异戊烯基焦磷酸( isoprenyl pyrophosphate, IPP)和倍半萜前体法呢基焦磷酸( farnesyl pyrophosphate,FPP,C15)缩合形成的,它是二萜化合物的通用前体,为多种二萜、类胡萝卜素、叶绿素、醌和维生素E侧链等的提供构建骨架。由于GGPP是多种初生和次生代谢物的共同前体,因此,GGPP合酶能够起到调节碳流的作用,从而成为初生和次生代谢途径中的关键酶之一。 GGPP合酶普遍存在于植物、动物和细菌中,具有很高的保守性,在进化关系上具有明显的种族特异性,动物、植物、细菌、真菌和古细菌来源的GGPS蛋白序列在进化上属于不同的分支。对模式植物拟南芥GGPS的研究表明,在植物体内存在多个GGPS基因,不同酶型的GGPS在细胞中的定位不同,它们的表达亦具有时空特异性,其在代谢途径中的作用亦不同。已经知道的以GGPP为前体的具有药用价值的化合物有紫杉醇、银杏酚等,且已证明GGPS是决定红豆杉植物合成紫杉醇类物质的关键酶之一。 利用GGPS中两个富含天冬氨酸的保守区域FARM(the first aspartate-rich motif,II区)和SARM(the second aspartate-rich motif,V区)设计简并引物,通过同源扩增的方法获得400bp左右的与已报道其它植物中的GGPP合酶序列相似的核心序列,再用cDNA末端快速扩增技术(RACE)得到3’端和5’端序列,拼接三段序列,最终获得两条长度分别为1 298bp和1 177bp的丹参GGPScDNA序列,将其命名为SmGGPS1和SmGGPS2。生物信息学分析表明,它们分别具有1 095bp和1035bp的ORF框,与已报道的多个植物GGPS基因具有60%以上的一致性;推断其编码364个和344个氨基酸序列,分子质量分别为38 986.6和37 373.4,等电点分别为6.29和6.78,均具有多聚异戊二烯基合成酶的特异序列;TargetP 1.1在线分析它们的N端可能分别具有52个氨基酸和19个氨基酸的信号肽序列,引导这两个蛋白依次定位于质体和线粒体。RT-PCR半定量分析表明,这两个基因在所分析的各组织中均有表达,但SmGGPS1在成熟期(花期)叶片中的表达最强,而SmGGPS2则在成熟期的根和成花中表达最强;基因结构分析表明SmGGPS1基因有一397bp的内含子,而SmGGPS2则不带内含子。通过Gateway技术构建酵母表达载体,将其转化至GGPS缺陷的低温敏感型酵母菌株SFNY368,利用功能互补的原理,确证了SmGGPS1编码蛋白的确具有GGPP合酶;而SmGGPS2却不能很好的回复SFNY368的低温生长能力,分析可能是其信号肽序列的定位功能影响到该基因在酵母中的表达,需要进一步去除信号肽序列再确证其功能。 针对经过生化功能确定的SmGGPS1基因,分别构建了RNAi载体、过表达载体及两个相关的阴性对照空载体。利用SmGGPS1-RNAi载体,首次建立了发根农杆菌ACCC10060介导的外源基因转化丹参的体系,所得转基因毛状根具有抗生素和GFP双筛选标记,平均诱导率和转化率均可达50%以上。用同样的转化方法分别获得SmGGPS1过表达载体及其空载体对照转基因毛状根,分别选择20株过表达株系和17株空载体对照株系进行液体培养,45天后用代谢组学提取方法提取化合物,通过高效液相色谱(HPLC)检测分析,结果表明,过表达株系和空载体对照株系中含有丹参酮IIA的株系分别占90%和100%,含有丹参酮I的均为35%,而含有隐丹参酮的株系则分别占20%和71%;三种丹参酮类化合物的总量在空载体对照株系中基本呈正态分布,而过表达株系中除了15#特别多外,其余样本含量均不显著;这说明SmGGPS1的过表达导致了隐丹参酮含量的显著降低,进而引起了丹参酮类化合物总量的减少;选取19个由HPLC检测得到的化合物,对其进行主成分分析,结果显示过表达株系和空载体对照株系完全可以从化合物的角度被分开,说明过表达组的化合物检测结果并不是随机事件,而是SmGGPS1基因表达水平改变后的整体特征;同时找到了5个可作为代谢标识物的物质;聚类分析将这19个化合物分成了三类,其中两类可能与丹参酮类化合物的合成相关。利用根癌农杆菌介导转化分别得到了32株SmGGPS1-RNAi2、10株SmGGPS1-RNAi3和41株pDONR(-)转基因植株,其中有8株RNAi2植株和1株RNAi3植株肉眼可见的显著表型为根缩短、叶发黄,这提示赤霉素含量的升高及叶绿素和/或类胡萝卜素含量的降低。 结论:首次获得了两个丹参GGPP合酶基因,并通过酵母互补实验确证了SmGGPS1的生化功能;首次建立了发根农杆菌介导外源载体转化丹参的体系;通过分析过表达转基因毛状根中化合物的变化和RNAi转基因植株的表型,将这两个结果相联系,可以推测SmGGPS1在丹参中的主要作用之一是合成叶绿素和/或类胡萝卜素,而不参与赤霉素和丹参酮类物质的合成;但同时结果亦指示,在GGPP之后,赤霉素和丹参酮类物质在生物合成途径中可能有一段共同的合成步骤,而后才进入各自的特异分支途径中。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S567.53

【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 化文平;宋双红;智媛;王喆之;;丹参SmGGPPS3基因的克隆及表达分析[J];植物科学学报;2014年01期
中国博士学位论文全文数据库 前3条
1 徐立新;MeJA对人参DS基因表达的影响及DS在酵母中的表达[D];吉林大学;2011年
2 李东;热胁迫下丹参次生代谢比较转录组学研究[D];四川农业大学;2011年
3 金士琨;人参2,3-氧化角鲨烯代谢途径中关键酶的表达调控研究[D];吉林大学;2014年
中国硕士学位论文全文数据库 前4条
1 周晓丽;不同产地丹参质量的EST-SSR分子标记与功能基因表达研究[D];北京中医药大学;2011年
2 刘宁;人参SQE与DS基因cDNA的克隆、原核表达及功能的初步研究[D];吉林农业大学;2012年
3 何沐阳;干扰人参CS基因的表达对人参三萜成分含量的影响[D];吉林大学;2013年
4 邹芳玲;GGPS基因在番茄中的无选择标记遗传转化研究[D];中国农业科学院;2013年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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6 罗琎;孙长忠;王琦;辛学兵;孔庆云;;根系的发育及其激素调控研究[J];安徽农业科学;2008年26期
7 杨秀峰;李凤兰;孙旭红;佟伟霜;胡宝忠;;欧李扦插影响因子及生根机理的研究[J];安徽农业科学;2009年14期
8 梁立东;杨玲;沈海龙;刘春苹;;新西伯利亚银白杨微枝试管外生根与微环境因子的关系[J];安徽农业科学;2009年30期
9 汪小雄;杨映根;;日本落叶松体细胞胚胎发生的研究[J];安徽农业科学;2010年04期
10 石岭;鱼红闪;金凤燮;;丹参药渣中丹参酮的提取研究[J];安徽农业科学;2010年09期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 姜福星;刘凤栾;赵梁军;;植物类原球茎研究进展[A];中国观赏园艺研究进展2011[C];2011年
2 王康才;罗庆云;陈红霞;;生长调节剂对丹参愈伤组织诱导及根芽分化的影响[A];中国科协第3届青年学术年会园艺学卫星会议暨中国园艺学会第2届青年学术讨论会论文集[C];1998年
3 田亦平;王四清;;不同季节和IBA浓度对布朗忍冬扦插生根的影响[A];中国观赏园艺研究进展(2010)[C];2010年
4 黄志伟;郑金贵;郭明殊;;三萜类化合物的药理作用及代谢调控的分子生物学研究进展[A];福建省科协第五届学术年会提高海峡西岸经济区农业综合生产能力分会场论文集[C];2005年
5 张丽红;张志荣;韩丽妹;王建新;;丹参总酚酸脂质体的制备和药剂学性质研究[A];2006第六届中国药学会学术年会论文集[C];2006年
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7 张秋燕;崔翰明;张春光;王阶;;丹参水溶性成分的纯化工艺和质量研究[A];2009年中国药学大会暨第九届中国药师周论文集[C];2009年
8 张秋燕;崔翰明;张春光;王阶;;丹参水溶性成分的纯化工艺和质量研究[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
9 李天航;杨晶;王艳芳;郭咏昕;李昌禹;李海燕;李校堃;;发状根在药用植物基因工程研究进展[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
10 冯健;林永启;刘洪江;董健;马晶;金刚;;利用SSH技术获得落叶松扦插生根过程中差异表达基因[A];第二届中国林业学术大会——S2 功能基因组时代的林木遗传与改良论文集[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 徐立新;MeJA对人参DS基因表达的影响及DS在酵母中的表达[D];吉林大学;2011年
2 王小刚;湖北麦冬种植优化和遗传多样性研究[D];华中科技大学;2011年
3 张来;竹节参离体培养与鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因的克隆及代谢研究[D];西南大学;2011年
4 施之琪;冠心丹参多相胶囊及其体外评价方法的研究[D];广州中医药大学;2011年
5 闫绍鹏;欧美山杨杂种扦插生根的理化与分子机理研究[D];东北林业大学;2011年
6 付伟;罗汉果二倍体及四倍体遗传变异研究[D];北京协和医学院;2011年
7 孙潇;冠心丹参方对氧化应激性心肌细胞损伤保护作用的物质基础及作用机制研究[D];北京协和医学院;2011年
8 申培红;siRNA对乳腺癌特异性基因表达影响及与S100A4、ETS1、VEGF、CD105基因表达关系的研究[D];郑州大学;2011年
9 王士杰;茉莉酸甲酯诱导的人参发根培养及SSH文库构建研究[D];吉林农业大学;2011年
10 李东;热胁迫下丹参次生代谢比较转录组学研究[D];四川农业大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 钟淑梅;蒲公英人工加倍及其应用价值研究[D];华中农业大学;2010年
2 黄振;马尾松幼苗茎段和春梢茎段组织培养[D];中南林业科技大学;2009年
3 李晓东;茶树体细胞胚发生的影响因素及超微结构和几种内含物质变化的研究[D];山东农业大学;2010年
4 徐榕;自由人槭(Acer×freemanii)组培快繁技术体系的构建[D];山东农业大学;2010年
5 窦玥;两种槭树的组织培养和防治组培污染的初步研究[D];辽宁师范大学;2010年
6 孙健玲;半夏的快繁及诱导子对其愈伤组织总生物碱积累的影响[D];安徽农业大学;2010年
7 刘浩;萝卜细胞系的建立及萝卜硫素的提取与检测[D];甘肃农业大学;2010年
8 温睿婷;玉米成熟胚愈伤诱导及再生体系建立[D];甘肃农业大学;2010年
9 张丽娟;桃儿七离体培养体系的建立与发状根诱导研究[D];甘肃农业大学;2010年
10 张亚林;桃再生体系的优化与反义PG基因遗传转化的研究[D];甘肃农业大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 宋显军;张伟;曹萍;郭玉华;谢甫绨;;大豆SSR标记PAGE银染方法的改进[J];安徽农业科学;2006年16期
2 刘强;丛丽娜;张宗申;;植物甾醇与三萜类皂苷生物合成基因调控的研究进展[J];安徽农业科学;2006年19期
3 李建明;李洪杰;柴守诚;李秀全;李立会;;普通小麦Genomic-SSR和EST-SSR分子标记遗传差异[J];安徽农业科学;2007年26期
4 邹礼平;高和平;钟亚琴;;植物番茄红素生物合成相关基因的表达调控研究进展[J];安徽农业科学;2009年33期
5 简捷;胡志方;黄缘;;人参皂苷Rg3对人胰腺癌细胞Pim-3及Bad凋亡蛋白表达的影响[J];癌症;2009年05期
6 高雪;;植物苯丙氨酸解氨酶研究进展[J];现代农业科技;2009年01期
7 张明哲;王真慧;张美萍;王义;孙春玉;蒋世翠;;人参SQS和SE酶基因的克隆及其表达载体的构建[J];现代农业科技;2010年04期
8 孟凡娟,王富;番茄果实内番茄红素的合成及影响因素[J];北方园艺;2001年05期
9 魏振林;董玲;焦传珍;陈英剑;;转基因草莓植株cNHX1基因表达水平和拷贝数的Real Time PCR分析[J];北方园艺;2007年05期
10 王莉;张艳霞;史玲玲;刘玉军;;功能基因组学和代谢组学技术在植物次生代谢物合成及调控研究中的应用[J];北京林业大学学报;2007年05期
中国博士学位论文全文数据库 前7条
1 徐立新;MeJA对人参DS基因表达的影响及DS在酵母中的表达[D];吉林大学;2011年
2 陈新;银杏苯丙氨酸解氨酶(PAL)的基因克隆和生物信息学分析[D];成都中医药大学;2003年
3 刘春生;ITS序列和β-香树酯醇合成酶基因与甘草酸形成和积累的相关性研究[D];北京中医药大学;2006年
4 王学勇;丹参毛状根基因诱导表达分析及其有效成分生物合成基因的克隆研究[D];中国中医科学院;2007年
5 梁彦龙;反义抑制环阿乔醇合成酶基因对人参发根皂苷合成的影响[D];吉林大学;2009年
6 马建;大豆脂肪氧化酶基因RNAi表达载体的构建及表达调控的研究[D];吉林农业大学;2008年
7 侯春喜;人参皂苷生物合成关键酶基因MVD和βAS的克隆及βAS的反义表达[D];吉林大学;2009年
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1 夏诏杰;提高重组酵母质粒稳定性和蛋白质产率的培养策略研究[D];西北大学;2002年
2 段艳冰;丹参中迷迭香酸生物合成途径的苯丙氨酸支路基因的克隆及研究[D];第二军医大学;2006年
3 李倩;环境因子对丹参生长及活性成分累积的影响规律研究[D];西北农林科技大学;2006年
4 宋玉刚;反义鲨烯合酶基因表达对青蒿素生物合成的影响[D];中国科学院研究生院(植物研究所);2006年
5 徐立新;植物激素和诱导子对人参发根皂苷含量的影响研究[D];吉林大学;2007年
6 李红艳;人参水溶性蛋白及鹿茸胶原蛋白的活性研究[D];长春中医药大学;2007年
7 贺玉林;丹参有效成分的积累及其与生态因子的关系[D];中国协和医科大学;2007年
8 易博;丹参迷迭香酸代谢酪氨酸支路重要基因克隆及调控分析[D];第二军医大学;2007年
9 宛国伟;诱导子对丹参酚酸类化合物含量及合成酶的影响[D];西北农林科技大学;2008年
10 化文平;丹参GGPP合酶基因的克隆及表达分析[D];陕西师范大学;2008年
【二级引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 胡薇;刘宁;田玉华;李雨婷;张连学;;人参鲨烯环氧酶基因的克隆与原核表达[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2012年10期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 许宝红;感病草鱼脾脏的比较转录组分析[D];湖南农业大学;2012年
2 张宇;扁蓿豆抗寒相关基因的克隆与表达分析[D];内蒙古农业大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 刘宁;人参SQE与DS基因cDNA的克隆、原核表达及功能的初步研究[D];吉林农业大学;2012年
2 何沐阳;干扰人参CS基因的表达对人参三萜成分含量的影响[D];吉林大学;2013年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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6 王忠永,邱会芬;丹参酮对痤疮患者血清性激素水平的影响及临床疗效观察[J];中国医师杂志;2001年04期
7 季新梅,董春艳,苑丽华,徐晓华;丹参酮治疗原发性痛经203例临床分析[J];中国医师杂志;2001年06期
8 许铁峰,张汉明,张威,丁如贤,李博华;应用发根农杆菌RiT-DNA建立菘蓝的毛状根优质株系和植株再生系统[J];第二军医大学学报;2000年10期
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10 何金涛,周清华,袁淑兰,王艳萍,陈晓禾,秦建军;丹参酮对人肺癌细胞株的增殖抑制作用及其分子机理[J];中国肺癌杂志;2002年02期
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