收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

DNA-PKcs调控有丝分裂进程与机制

尚增甫  
【摘要】: DNA-PKcs是DNA依赖蛋白激酶的催化亚单位(DNA Dependent Protein Kinase Catalytic Subunit),与另外两个亚单位Ku70和Ku80共同构成DNA-PK复合物。与ATM、ATR等同属于磷脂酰肌醇3-激酶相关蛋白激酶(Phosphatidyl inositol-3-kinase-like kinase, PIKK)超家族成员。最初确定的DNA-PKcs的功能是参与DNA双链断裂的非同源末端连接(NHEJ)和V(D)J重组,后来又发现其在维持染色体端粒末端结构稳定性中发挥重要的作用。研究显示DNA-PKcs以其丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶活性可磷酸化多种重要的功能蛋白底物,包括有多种癌基因产物和转录因子,如Artimes、Akt、H2AX、c-fos、c-myc、oct-1、c-jun等,表明DNA-PKcs是一种具有多种功能的蛋白。 近年来有越来越多的实验研究报道,DNA-PKcs在肿瘤组织中异常高表达。本实验室的前期研究发现,在辐射诱发的部分癌变细胞中DNA-PKcs表达和激酶活性均显著提高;通过免疫组化分析显示约90%的肝癌患者的癌组织中DNA-PKcs表达呈强阳性,而对照的正常肝组织中所检测到的DNA-PKcs水平明显要低;发现DNA-PKcs通过Akt/GSK3β/c-Myc的信号调节通路调节c-Myc蛋白稳定性,提示DNA-PKcs很可能参与细胞恶性化过程。此外,某些组织来源细胞的不同发育阶段DNA-PKcs的表达水平也不同,生殖细胞减数分裂前DNA-PKcs表达明显高于减数分裂后,而一些没有增殖能力的细胞根本不表达DNA-PKcs或DNA-PKcs表达水平非常低,提示DNA-PKcs参与细胞增殖过程。 最近有实验研究报道,DNA-PKcs参与DNA损伤后G2/M期监测点调节过程。而且有报道,DNA-PKcs等DNA损伤蛋白定位于中心体结构,种种证据显示,DNA-PKcs可能通过细胞周期调节细胞增殖生长。本论文利用DNA-PKcs表达抑制细胞模型等,通过电离辐射等诱发DNA损伤,研究DNA-PKcs对细胞有丝分裂过程中纺锤体、中心体等重要亚细胞结构和功能的调节作用,观察DNA-PKcs功能缺失后DNA损伤细胞周期监测点功能变化和细胞死亡机制,取得了如下主要进展: (1)用4Gyγ射线照射或拓扑异构酶IIα抑制剂doxorubicin作用后, DNA-PKcs沉默的HeLa-H1细胞G2-M期阻滞时间显著延长、出现高比例的多倍体和大量多核细胞(30%~40%),有丝分裂中期细胞多中心体或多极纺锤体细胞比率也明显高于对照细胞。共聚焦显微镜实时监测技术观察到照后24h-48h DNA-PKcs沉默细胞中出现胞质分裂失败、有丝分裂期时间延长、核分裂无法完成等现象,导致有丝分裂灾变最终凋亡,说明DNA-PKcs对DNA损伤细胞有丝分裂发挥重要的调控作用;进一步利用RNA干扰技术在HepG2细胞中稳定下调DNA-PKcs蛋白表达,同样观察到多核细胞增加、多极纺锤体和有丝分裂灾变死亡等现象。 (2)首次确定了对于DNA-PKcs发挥功能至关重要的磷酸化形式(pT2609)在细胞周期不同时期的亚细胞定位。发现DNA-PKcs pT2609在有丝分裂期细胞中的定位随有丝分裂进程的变化而改变,先特异定位于着丝粒和中心体、随后定位在纺锤体中心,胞质分裂期末期聚集在中体,而DNA-PKcs pT2647在细胞有丝分裂期定位于中心体,没有观察到在着丝粒和中体的定位,表明DNA-PKcs不同的磷酸化形式具有不同的生物学功能。 (3)发现DNA-PKcs pT2609在细胞有丝分裂期与Plk1在不同的亚细胞区域共定位,免疫共沉淀、GST-pull down发现两者存在体内体外相互作用,进一步提示两蛋白功能相关。同时发现DNA-PKcs沉默下调Plk1蛋白水平,但mRNA水平不受影响,表明DNA-PKcs可能通过调节Plk1蛋白稳定性参与对细胞有丝分裂调节过程;另外,DNA-PKcs沉默细胞中,照射后Chk2 T68磷酸化水平下降,并且DNA-PKcs与Chk2存在相互作用。正常细胞中Chk2 T68磷酸化水平随细胞周期变化而变化,在G2/M期达高峰,但在DNA-PKcs沉默的HeLa细胞中,这种周期性变化消失,提示在细胞周期及DNA损伤后细胞周期监测点调节过程中DNA-PKcs可能是Chk2上游分子。 (4)本研究发现DNA-PKcs与p53诱导凋亡相关蛋白PIG3的相互作用,该复合体中还包含有转录抑制因子KAP-1,并在辐射诱发的DSBs损伤位点聚集。还观察到PIG3可与p53相互作用并抑制p53转录活性,提示PIG3可能参与DNA损伤后对p53转录活性的调节过程,而DNA-PKcs可能参与其中。 (5)本研究还发现c-Myc蛋白的294-370区域与DNA-PKcs存在相互作用。c-Myc的294-370缺失体在HeLa细胞中的蛋白量(稳定性)显著高于全长c-Myc或其它截短体蛋白,提示该区域是c-Myc蛋白降解结构域。DNA-PKcs与294-370区域的结合,可能在物理结构上封闭了其它蛋白对该区域的作用,从而影响了c-Myc蛋白的稳定性。同时发现DNA-PKcs沉默细胞中,c-Myc蛋白下游蛋白p27蛋白水平升高,cyclinE蛋白水平降低,表明DNA-PKcs可能通过对c-Myc蛋白的调节,也间接参与细胞周期调节过程。 本研究提供了多方面的有力证据,表明了DNA-PKcs对细胞有丝分裂进程及DNA损伤诱发细胞周期监测点机制的重要调控作用,揭示了DNA-PKcs的DNA修复功能以外的重要生物学作用。鉴于本研究发现,DNA-PKcs还将是一个抗肿瘤药物或技术措施研究的有效分子靶标。本研究还初步揭示了DNA-PKcs可能在p53转录活性的调节过程中发挥功能。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 陈叙龙,张清敏,张毓琪,张宝东,陈素平;鲤鱼肝胰脏线粒体DNA的分离、纯化方法[J];环境化学;1994年03期
2 周晓慧;DNA与免疫[J];承德医学院学报;1998年02期
3 张爱民,张建民;论基因组的分子进化[J];菏泽师范专科学校学报;1998年02期
4 房经贵,章镇,刘大钧,马正强,JossiHillel;一种从贮藏较久番茄叶中提取适于PCR扩增的DNA的方法[J];植物生理学通讯;2000年01期
5 朱长军,张利宁,马春红,曹英林,宋静;一种新型杆状病毒亲本株的鉴定及病毒DNA的纯化[J];山东医科大学学报;2000年01期
6 张秀花,弓巧娟;分子内电荷转移荧光探针DMAHF的介质效应及与DNA的作用[J];山西大学学报(自然科学版);2000年01期
7 宗仁鹤,白春礼,李振刚,汪新文,聂焰,龚为穗,杨安庆,龚立三;激光对DNA作用机理的AFM研究[J];激光生物学报;2001年01期
8 宗志新,龚国权;阿的平荧光猝灭法测定 DNA(英文)[J];兰州大学学报(自然科学版);2002年02期
9 张李阳;固体发酵红曲霉菌生物量测定方法的研究[J];南京晓庄学院学报;2002年04期
10 徐治立;论基因科技的二重性[J];系统辩证学学报;2002年03期
11 罗文永,陈建伟,刘彦卓,肖昕,毛兴学,李晓方;快速鉴定阳性重组质粒方法的改进试验[J];广东农业科学;2004年02期
12 张志忠,吴菁华,吕柳新,陈桂信;一种适于PCR检测的DNA微量提取方法[J];亚热带植物科学;2004年01期
13 宫霞 ,施用晖 ,乐国伟;抗菌活性肽与细菌染色体DNA的相互作用机理[J];自然科学进展;2004年05期
14 沈子威,王竞,张志诚,黄美珍;激光诱导动物细胞基因转移的研究[J];清华大学学报(自然科学版);1991年06期
15 张四明;分子生物学技术及其在渔业科学中的应用[J];水产学报;1997年S1期
16 沈鹤柏,倪丽华,杨海峰,王则民,章宗穰;稀土金属离子对DNA作用的紫外和荧光光谱法研究[J];上海师范大学学报(自然科学版);1998年01期
17 曾宪春,罗锋,蒋达和,朱帆,李文鑫;一种快速有效纯化DNA序列分析模板的方法[J];生物技术;1998年05期
18 张永良,胡海霞,郭庆林,沈喜,李春光,郑世英,徐利泉,周富高;精子DNA微波Feulgen染色及意义[J];中国优生与遗传杂志;1998年04期
19 谢菊芳,宋国清,廖贡献,张菁,居超明;PCT高压静电场的植物细胞效应及量子模型[J];电子学报;1999年06期
20 张蓉颖,庞代文,蔡汝秀;DNA与其靶向分子相互作用研究进展[J];高等学校化学学报;1999年08期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 刘海英;陈刚;步宇翔;;碱基对的多铜修饰对DNA导电性的增强作用[A];中国化学会第28届学术年会第13分会场摘要集[C];2012年
2 赵宏远;李俊杰;桑润滋;;单细胞凝胶电泳技术检测不同处理山羊精子DNA损伤[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(下册)[C];2010年
3 刘玲;付强;朱化彬;彭秀丽;郝海生;杜卫华;赵学明;王栋;;牛毛囊基因组DNA制备方法的比较研究[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(上册)[C];2010年
4 梁春柳;;一个新的筛选化合物与DNA交互作用的简便方法[A];2010年全国药物毒理学学术会议论文集[C];2010年
5 张文众;李永宁;方瑾;梁春来;张倩男;;体外新评价方法——完整细胞核DNA检测板[A];全国生化/工业与卫生毒理学学术会议论文集[C];2010年
6 邹丹丹;汪海林;;基于DNA甲基化结合蛋白MBD的甲基化分析[A];中国化学会第28届学术年会第2分会场摘要集[C];2012年
7 张晔;杜智;杨斌;高英堂;;检测外周血中游离DNA的应用前景(综述)[A];天津市生物医学工程学会第29届学术年会暨首届生物医学工程前沿科学研讨会论文集[C];2009年
8 赵淑珍;刘光珍;;DNA免疫吸附治疗狼疮性肾炎的临床观察[A];第十一届全国中西医结合肾脏病学术会议论文汇编[C];2010年
9 陈士林;;中药DNA条形码鉴定体系[A];第十届全国药用植物及植物药学术研讨会论文摘要集[C];2011年
10 陆佳飞;周克隆;王缦;;磁珠法快速提取乙型肝炎病毒DNA的研究及其在诊断试剂中的应用[A];第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 郭晓兰;端粒功能异常诱导的DNA损伤反应及其在肿瘤发生中的作用与分子机制[D];重庆医科大学;2010年
2 陈志健;1.8 GHz微波对X射线和阿霉素致淋巴细胞DNA损伤修复及对蛋白表达的影响[D];浙江大学;2010年
3 朱慧芳;Y家族DNA聚合酶对化学致癌物MNNG应答的转录调控研究[D];浙江大学;2009年
4 万超;抗猪瘟嵌合DNA疫苗及TRIF的DNA疫苗佐剂效应研究[D];武汉大学;2009年
5 赵丽霞;克隆绵羊印记相关基因的DNA甲基化研究[D];内蒙古农业大学;2010年
6 沈美龙;基于DNA免疫的乙型肝炎病毒表面抗原大中小蛋白的免疫原性研究[D];南京医科大学;2010年
7 徐铁刚;细菌DNA磷硫酰化修饰与限制[D];上海交通大学;2008年
8 高鹏;特异性介导DNA转导的多结构域嵌合蛋白的构建、表达及鉴定[D];吉林大学;2011年
9 康大伟;DNA分子器件场效应理论研究[D];山东大学;2010年
10 高天;基于寡核苷酸芯片的地中海贫血特异性DNA甲基化的研究[D];第三军医大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李芳;基于磁性微粒的法医样本DNA纯化[D];西北大学;2011年
2 芦丽淦;柚皮素及聚乙二醇增强乙肝DNA疫苗免疫效果的研究[D];河南大学;2010年
3 杨锦艳;六种香豆素有效成分与DNA相互作用的研究[D];山西医科大学;2010年
4 林启凰;用于乳腺蛋白标志基因检测的DNA电化学生物传感器的研究[D];福建医科大学;2010年
5 于文静;亚麻韧皮部特异启动子克隆与26份种质DNA指纹图谱构建[D];中国农业科学院;2010年
6 Rebecca Simisola Agboola;硼(B)和氯化钠胁迫处理诱导高粱(Sorghum bicolor)自交系发生形态和DNA甲基化的变异[D];东北师范大学;2010年
7 石微;溴氰菊酯致大鼠DNA损伤及损伤后修复功能的影响[D];青岛大学;2010年
8 张诺;DNA-纳米羟基磷灰石修饰电极的制备及在生物分析中的应用[D];济南大学;2010年
9 郭珈辰;基于图形表示的DNA相似性分析及进化树构建算法研究[D];湖南大学;2010年
10 刘香港;基于功能材料的新型电化学DNA生物传感器的研制及应用研究[D];山东农业大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 陈杰;信息技术将重组汽车DNA[N];科技日报;2010年
2 刘霞;科学家研发出新型人工合成DNA载体[N];科技日报;2010年
3 南方;化危为机 企业需韧性生长的DNA[N];中国企业报;2009年
4 吴强;港大引新技术DNA辨食材[N];中国食品质量报;2010年
5 本报记者 施晓焰 通讯员 马丽娟;云南:DNA数据库成“打拐”得力帮手[N];人民公安报;2009年
6 张巍巍;垃圾DNA可促进癌症发展首获证实[N];科技日报;2010年
7 常丽君;虱子DNA表明人类17万年前首次穿衣[N];科技日报;2011年
8 记者 冯卫东;DNA碱基序列决定其光敏性假设获证实[N];科技日报;2008年
9 许文强;拆、装更便捷的DNA双螺栓结构模型[N];大众科技报;2008年
10 记者 常丽君;研究人员发现自组装DNA链的最佳长度[N];科技日报;2010年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978