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《中国人民解放军军事医学科学院》 2010年
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应激致心肌细胞凋亡过程中TR3移位线粒体的分子调控机制

孔瑞瑞  
【摘要】: 目的:认识应激条件下心肌细胞中MAPK信号通路活化,和Hsp70表达水平的改变对TR3核输出和移位线粒体的影响,揭示应激所致心肌细胞凋亡过程中TR3移位线粒体的分子机制,为阐明应激机体心肌损伤的分子机制提供科学依据。 方法:以10-5mol/L糖皮质激素(GC)诱导心肌细胞凋亡,建立离体心肌细胞应激损伤实验模型;采用酶标仪检测离体细胞模型中Caspase 3酶的活性,用流式细胞术检测心肌细胞凋亡率,用Hochest33342染色鉴定心肌细胞凋亡情况,用MTT法(四唑盐比色法)测定心肌细胞存活率。采用Western blotting方法和免疫沉淀法观察模型中MAPK家族的三个成员JNK、ERK1/2、p38以及TR3的蛋白表达和磷酸化水平;应用SP600125、PD98059、SB203580分别调控JNK、ERK1/2和p38的磷酸化水平,观察其对TR3磷酸化水平及线粒体移位的影响。用Hsp70表达的化学抑制剂KNK437调控Hsp70表达水平,采用Western blotting方法观察离体细胞模型中Hsp70表达水平变化。 结果:10-5mol/L GC作用于心肌细胞24小时后,细胞中Caspase 3酶活性明显增强;心肌细胞凋亡率显著升高;Hochest 33342染色能检测到心肌细胞凋亡过程中出现的胞核中断裂的DNA片段;心肌细胞存活率显著下降。GC干预心肌细胞后,细胞内MAPK信号网络显著活化,其中JNK磷酸化水平在GC作用10min至60min时明显升高,ERK1/2磷酸化水平20min至60min时显著升高,而p38磷酸化水平未见明显变化。TR3磷酸化水平在40min至60min时可见明显升高。抑制JNK磷酸化后,TR3磷酸化水平明显降低,线粒体中TR3含量亦明显减少;并继而导致Caspase 3酶的活性显著下降,心肌细胞凋亡率显著下降,心肌细胞存活率显著升高。但抑制ERK1/2磷酸化,并未发现TR3磷酸化水平明显变化。以上结果表明应激心肌细胞中活化的JNK信号通路对TR3磷酸化和移位线粒体有重要促进作用。进一步观察应激心肌细胞中Hsp70对TR3移位线粒体的影响,可发现应激导致心肌细胞Hsp70表达水平显著升高,促进Hsp70与TR3的相互作用。用KNK437抑制应激心肌细胞内高表达的Hsp70后,可见TR3向线粒体移位明显受抑,线粒体中TR3含量亦明显减少。但未见心肌细胞中Caspase 3酶的活性明显下降及细胞凋亡率的受抑;心肌细胞存活率亦未明显升高;提示应激心肌细胞中高表达的Hsp70虽可促进TR3向线粒体移位,但可能通过其它的生物学途径阻抑应激心肌细胞损伤的发生。 结论:在应激导致心肌细胞凋亡过程中,MAPK信号网络中的JNK通路活化增强,导致TR3磷酸化并从胞核移位线粒体,诱导细胞凋亡的发生。应激心肌细胞中显著升高的Hsp70通过与TR3相互作用协助TR3向线粒体移位。
【学位授予单位】:中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R541

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