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补体介导的免疫病理损伤在重症肝炎发病中的作用及机制研究

郭彦  
【摘要】: 重症肝炎的病死率非常高,病情发展迅速、凶险,临床预后差,尽管对其致病机制等展开了大量的研究工作,但目前对其致病机理仍不十分清楚。鉴于临床重症肝炎致病因素多样,肝损伤机理复杂,不同诱因所引起的重症肝炎在病理损伤、致病机理既有相似之处,也有不同的方面。因此,建立由不同因素引起的动物模型对深入开展重症肝炎急性肝损伤的机制研究具有重要意义。补体是机体免疫防御的第一道防线,但补体的过度激活又是造成免疫病理性损伤的介质。补体在重症肝炎免疫病理损伤及发病机制中的生物学作用还少见报道。 本研究建立LPS/D-GalN诱导小鼠重症肝炎急性肝损伤和MHV-3病毒感染小鼠重症肝炎急性肝损伤动物模型,研究这两种模型,并利用C3缺陷鼠(C3-/-)、靶向补体抑制剂(CR2-FH)阻断补体旁路激活途径以及阻断补体片段C3a与其受体C3aR的结合等方面探索补体介导的免疫病理损伤在重症肝炎急性肝损伤中的作用,为探索临床干预治疗提供实验和理论依据。 一、补体在LPS/D-GalN诱导小鼠重症肝炎急性肝损伤中的作用研究 1、LPS/D-GalN诱导小鼠重症肝炎急性肝损伤模型建立:以不同剂量LPS/D-GalN腹腔注射C57BL/6小鼠,观察存活时间及肝脏损伤大病理,确定实验LPS/D-GalN使用剂量。并在不同时间点观察模型肝组织病理损伤,检测血清中ALT表达水平以及炎症因子水平。结果显示该模型呈现重症肝炎急性肝损伤进程性病变。该模型稳定、易行,可为急性肝损伤的实验研究提供理想的免疫病理损伤模型。 2、补体在重症肝炎急性肝损伤免疫病理研究:采用免疫组化技术检测不同时间点各组小鼠肝组织中C3的沉积与分布,Real Time PCR技术检测不同时间点肝组织补体受体C3aR、C5aR表达水平变化。结果显示,与正常C57BL/6小鼠组相比,染毒小鼠的补体C3在肝脏组织的沉积呈动态变化,1h时沉积增加,主要沉积在肝中央静脉周围,但4h时表达减少,8h时再次达高峰,主要沉积在组织坏死区域。同时,C3aR表达水平1h时升高,4h下降,8h时再达高峰。C5aR表达水平持续升高,8h时达高峰。实验结果表明小鼠染毒后肝组织损伤的程度与补体成分在肝内表达情况密切相关,补体的过度激活导致肝组织补体C3沉积的增加,并诱导C3aR、C5aR在肝细胞的异常表达。 3、阻断补体激活途径在LPS/D-GalN诱导小鼠重症肝炎急性肝损伤模型中的作用研究 (1)阻断补体C3激活途径减轻小鼠重症肝炎急性肝损伤:采用LPS(50ng)/D-GalN(6mg)腹腔注射C3-/-小鼠及C57BL/6小鼠,比较两组小鼠急性肝损伤的差异:观察肝组织病理HE染色及检测不同时间点(0h、1h、4h、8h)血清中炎症因子和ALT表达水平变化,比较两组小鼠存活率。结果显示,同一时间点的炎症因子IL-6、MCP-1及TNF-α表达水平C57BL/6小鼠要高于C3-/-小鼠,且C3-/-小鼠的病情严重程度要明显轻于C57BL/6小鼠,病程发展也要较C57BL/6小鼠缓慢。同时,阻断补体C3激活途径能延长小鼠生存率。实验进一步证明补体在LPS/D-GalN诱导小鼠重症肝炎急性肝损伤中发挥着重要作用。 (2)阻断C3a与其受体C3aR结合减轻小鼠重症肝炎急性肝损伤:腹腔注射LPS/D-GalN前45min和后45min,尾静脉注射C3aR阻断剂40μg/只。观察各时间小鼠肝组织病理、血清ALT及血清炎症因子表达水平;并比较C3aR阻断小鼠与C57BL/6小鼠存活率。该实验结果显示C3aR阻断小鼠的存活时间明显长于C57BL/6小鼠。肝组织病理学显示C3aR阻断小鼠的肝损伤进程明显比C57BL/6小鼠缓慢,其病理损伤程度也比C57BL/6小鼠轻。C57BL/6小鼠的IL-6、TNF-α明显高于C3aR阻断小鼠。各时间点补体C3在C3aR阻断小鼠肝组织沉积较C57BL/6小鼠减少。因此,阻断C3a和其受体C3aR的结合,可降低急性肝损伤时炎症因子的升高,从而减低或推迟炎症因子介导机体的损伤。阻断C3aR有利于减轻急性肝损伤模型的病理损伤及炎症反应。 (3)利用靶向补体抑制物CR2-FH阻断补体旁路激活途径减轻C57BL/6小鼠肝组织病理损伤:腹腔注射LPS/D-GalN,即刻尾静脉注射CR2-FH,观察不同时间点肝组织病理损伤及补体C3在肝组织的沉积。结果显示,注射CR2-FH的小鼠其肝损伤进程明显缓慢于C57BL/6小鼠,其病理损伤程度也要比C57BL/6小鼠轻。 二、补体在MHV-3病毒感染小鼠重症肝炎急性肝损伤模型中的作用和机制研究 1、MHV-3病毒感染C57BL/6小鼠重症肝炎急性肝损伤模型建立:MHV-3腹腔注射C57BL/6小鼠,测定LD50及确定实验致死剂量。观察模型肝组织病理损伤及检测不同时间点血清中ALT表达水平变化以及血清炎症因子水平。同时检测不同时间点病毒滴度和病毒载量。结果显示,本实验建立的MHV-3感染小鼠导致病毒性重症肝炎急性肝损伤模型从肝组织病理学、血清ALT水平及炎症因子、病毒复制等方面来看,其病变有一定的发展,符合病毒性急性重症肝炎肝损伤发生发展的表现。能模拟肝炎病毒在肝组织内的复制过程和引起的损伤情况。 2、补体激活介导MHV-3病毒感染C57BL/6小鼠重症肝炎急性肝损伤:利用免疫组织化学、Real Time PCR等方法检测不同时间点小鼠肝组织中C3的沉积与分布及补体受体C3aR、C5aR表达水平变化。结果表明,与正常C57BL/6小鼠相比,补体C3水平在染毒后6h升高,12h达到高峰,但24h开始小鼠肝组织C3沉积减少,但72h时再次增加,且主要沉积在肝坏死区域。同时,C3aR、C5aR表达水平均呈先上升,再下降,再在72h升高的趋势,C3aR的第一个表达高峰在12h,而C5aR在6h。其结果都表明补体的激活与MHV-3感染小鼠致重症肝炎急性肝损伤密切有关。 3、阻断补体激活途径在MHV-3感染小鼠重症肝炎急性肝损伤模型中的作用研究: (1)阻断补体C3激活途径加重小鼠重症肝炎急性肝损伤:采用致死剂量的MHV-3病毒分别感染C3-/-小鼠及C57BL/6小鼠,比较两组小鼠急性肝损伤的差异。结果显示,在MHV-3感染小鼠重症肝炎急性肝损伤模型中,从组织病理学、血清生化、炎症因子及病毒复制等方面来看,虽然两组生存率之间没有差异(P0.05),但C3-/-小鼠的病程发展要快于C57BL/6小鼠,且同一时间点的病情也比C57BL/6小鼠严重。实验结果显示,在病毒性的急性肝损伤模型中,补体系统的激活可能对病毒发挥调理作用,抑制病毒复制和扩散,对机体主要起积极保护作用。 (2)阻断C3a与其受体C3aR结合加重小鼠重症肝炎急性肝损伤:建立C3aR阻断小鼠感染MHV-3致重症肝炎急性肝损伤模型,雌性C57BL/6小鼠48只,先尾静脉注射C3aR阻断剂40μg/只,1h后注射MH V-3病毒,间隔12h、36h后再分别注射C3aR阻断剂一次,剂量仍为40μg/只。研究结果表明,C57BL/6小鼠肝组织病变进程明显缓慢于C3aR阻断小鼠,补体C3在C57BL/6小鼠肝脏组织的沉积明显强于C3aR阻断小鼠。综上所述,从组织病理学、血清生化、炎症因子及病毒复制等方面来看,C3aR阻断小鼠的病程发展介于C3-/-小鼠与C57BL/6小鼠之间,且同一时间点的病情严重程度也介于两者之间。比C57BL/6小鼠严重,却比C3-/-小鼠稍轻。进一步提示C3a作为调理素在机体抗病毒方面也发挥重要作用。 通过上述两部分比较系统的实验,本研究发现,在LPS/D-GalN诱导小鼠重症肝炎急性肝损伤中,补体主要由旁路途径激活,其激活过程中产生的过敏毒素,能促进炎症的发生,同时补体能介导自身靶细胞的损伤,导致靶细胞的坏死;用靶向补体抑制剂CR2-FH能一定程度上阻断补体旁路途径的激活,减轻补体介导的免疫病理损伤。补体介导的免疫病理损伤在LPS/D-GalN诱导的小鼠重症肝炎急性肝损伤中发挥重要的致病作用。在MHV-3病毒感染急性肝损伤中,补体激活产生的调理素可促进吞噬细胞对病毒的吞噬作用,阻止病毒进入靶细胞,抑制病毒复制,减轻肝组织损伤;在由该类病毒性病原引起的重症肝炎肝组织损伤发病中,补体不是病理损伤的因素,而是通过抑制病毒复制,对机体起一定的保护作用。这与补体在LPS/D-GalN诱导的重症肝炎发病中介导的免疫病理损伤是完全不同的。


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