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《中国人民解放军医学院》 2013年
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SIRT1对胃癌恶性生物学行为的影响及作用机制研究

王鑫鑫  
【摘要】:胃癌是消化系统中最常见的恶性肿瘤,严重危害人类的健康。全球每年有90万的新发病例,我国每年有40万的新发病例。胃癌是我国发病率和死亡率都很高的恶性肿瘤之一,与世界各国比较,我国胃癌男、女性调整死亡率居世界之首。外科手术是胃癌治疗的主要方法,随着化疗、放疗、免疫治疗的进步,以及以手术为主的多学科MDT的综合治疗的发展,胃癌的治疗取得了一定的进步,但并没有从根本上改变胃癌高死亡率的现状,其总体生存率和无瘤生存率仍然很低。随着分子生物学技术的进步,多个分子和信号通路被证实影响着胃癌的恶性生物学行为,也出现了很多针对这些分子和信号通路的靶向治疗药物,但即便如此,进展期胃癌的5年生存率仍然只有20-30%。因此,迫切需要对胃癌进行更深入的研究,寻找新的分子生物标记物和信号通路,进一步明确胃癌的发生发展机制,为胃癌的诊断和治疗提供新的理论基础和实验依据。 乙酰化和去乙酰化是机体调控多种病理生理过程中重要的途径和方法。SIRT1(Silent information regulator1沉默信息调节因子1)是一个依赖NAD+的去乙酰化酶,它在正常的胚胎发育、分化及维持自身平衡中是必不可少的。SIRT1的大多数的功能是通过对基因表达过程中起关键作用的调节蛋白的针对性的去乙酰化而实现的。SIRT1的作用靶点包括转录因子以及代谢调节中的辅酶因子。SIRT1在维持健康及疾病中发挥着很多重要的作用。 在哺乳动物体内,SIRT1通过和P53、PGC-1α等组蛋白和非组蛋白的相互作用在细胞代谢方面起着非常重要的作用。SIRT1的去乙酰化作用可以作用于这些蛋白,在细胞生长、凋亡及肿瘤的发生和发展中发挥着作用。SIRT1在作用于细胞生长的同时,对于肿瘤细胞的作用在不同的组织上具有不同的效果。一直存在着关于SIRT1究竟是癌基因还是抑癌基因的争论,而SIRT1在胃癌中的研究在国内外的报道中很少提及。我们将通过研究SIRT1在人胃癌组织和胃癌细胞中的表达情况,探讨SIRT1在胃癌中的作用。 STAT3是一种多效转录因子,它可以被细胞因子、生长因子、癌基因等多种信号活化。能够根据上下游的信号激活不同基因表达,发挥多种生物学作用。STAT3促进细胞增殖,抑制凋亡,被认为是癌基因。STAT3是通过SIRT1去乙酰化作用而调节的细胞因子应答的转录因子,STAT3抑制了PGC-1α的转录。有研究发现STAT3在胃癌组织中表达增强,大量证据表明JAK/STAT通路的异常激活在胃癌的病理机制中有着重要的地位。细胞因子激活JAK/STAT的作用常常是一过性的,但是在胃癌细胞中却有着JAK/STAT的持续活化。很多的证据表明JAK1/STAT3活化在胃癌的发生重起着重要的作用。 我们将通过研究胃癌组织和胃癌细胞中SIRT1及STAT3的共同表达,探讨STAT3同SIRT1的关系,寻找SIRT1在胃癌发展过程中的分子机制,同时我们还将使用STAT3敲除的转基因小鼠建立胃癌模型,对比研究SIRT1在转基因小鼠胃癌组织中的表达,进一步寻找SIRT1在胃癌发展中的信号通路,找到靶向治疗的关键位点,为胃癌的治疗提供理论依据。 目的: 1,观察SIRT1在胃癌组织及胃癌细胞中的表达情况,并研究SIRT1同肿瘤临床病理特征之间的关系; 2,研究SIRT1在胃癌细胞增殖和凋亡中的作用; 3,探讨SIRT1在胃癌发展中的可能分子机制和信号通路。 方法: 1,应用实时定量PCR方法检测SIRT1mRNA在新鲜胃癌组织中的表达情况; 2,应用免疫印迹方法和实时定量PCR方法在蛋白水平和mRNA水平检测SIRT1在胃癌细胞中的表达; 3,应用免疫组织化学染色的方法,并利用图像分析技术比较SIRT1在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达; 4,分析SIRT1表达同胃癌患者的临床病理特征的相关性; 5,构建包装针对SIRT1的shRNA慢病毒载体,感染胃癌细胞及胃粘膜上皮细胞;应用荧光显微镜观察并应用免疫印迹方法证实转染的可靠性; 6,应用CCK-8法检测shRNA-SIRT1对胃癌细胞及胃粘膜上皮细胞增殖的影响; 7,APC-AnnexinV标记法,流式细胞仪检测shRNA-SIRT1对胃癌细胞及胃粘膜上皮细胞凋亡的影响; 8,实时定量PCR及免疫印迹法检测STAT3在转染shRNA-SIRT1及对照组胃癌细胞中的表达; 9,免疫共沉淀法分析SIRT1同STAT3、PSTAT3在胃癌中的相互作用关系; 10,建立STAT3敲除转基因小鼠胃癌模型; 11,免疫组织化学方法检测STAT3敲除转基因小鼠胃癌组织中SIRT1的表达情况。 结果: 1,SIRT1mRNA在21例新鲜胃癌组织中较正常癌旁组织表达增高,SIRT1mRNA及蛋白水平在三种人胃癌细胞中均比正常胃粘膜上皮细胞中表达增高。通过130例临床诊断胃癌患者的免疫组化染色,分析表明SIRT1在人胃癌组织中较正常癌旁组织表达增高,SIRT1的表达水平同患者的肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期及肿瘤大小密切相关。SIRT1表达水平同胃癌患者生存时间成负相关,关系密切。我们的研究发现SIRT1表达水平同患者年龄成正相关,但10例青少年胃癌患者中SIRT1的表达水平较年老组增高。 2,成功进行了携带以SIRT1为靶向的shRNA的慢病毒包装,并成功转染到人胃癌细胞中。通过对比研究转染shRNA-SIRT1和空转对照组的胃癌细胞,发现shRNA可以通过沉寂胃癌细胞中的SIRT1从而抑制了胃癌细胞的增殖,促进其凋亡,而对胃粘膜上皮细胞的增殖凋亡影响较小。 3,通过研究转染shRNA-SIRT1胃癌细胞中STAT3的表达,发现STAT3mRNA在shRNA-SIRT1组和对照组中表达无明显区别,而免疫印迹检测发现STAT3蛋白水平在胃癌细胞组和空转组中较shRNA组中表达增高,磷酸化P-STAT3与STAT3表达水平相同,而乙酰化A-STAT3的表达水平正好相反。进一步免疫共沉淀发现SIRT1同STAT3和PSTAT3能形成复合物。 4,应用STAT3敲除转基因小鼠胃癌模型,进行SIRT1表达的对比研究,发现SIRT1在STAT3敲除转基因小鼠胃癌组织中的表达较对照组降低,进一步说明了SIRT1和STAT3在胃癌发生发展过程中的相互作用。 结论: SIRT1作为依赖NAD+的去乙酰化酶,在机体细胞的生存、衰老和凋亡中发挥着重要的调节作用,但关于SIRT1是癌基因和抑癌基因的争论一直没有停止过,且其在胃癌中作用及机制研究少之又少。我们通过证实SIRT1在胃癌组织和胃癌细胞中的高表达,明确了其作为癌基因在胃癌发生中的作用。通过靶向应用于SIRT1的shRNA技术抑制了胃癌细胞的增殖,促进其凋亡,进一步明确SIRT1在胃癌细胞增殖和发展的作用,而且为生物基因治疗胃癌提供了实验基础。通过研究SIRT1同STAT3在胃癌中的相互作用关系,我们推测SIRT1可能通过对STAT3的去乙酰化作用,间接增强了活化的磷酸化STAT3,并形成SIRT1-STAT3复合物,促进了胃癌的发展。SIRT1可能通过JAK1-STAT3途径或直接激活STAT3参与胃癌的进展过程。为进一步研究SIRT1的分子机制和下游信号通路提供了理论基础和实验依据。
【学位授予单位】:中国人民解放军医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R735.2

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【参考文献】
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