收藏本站
《中国人民解放军医学院》 2013年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

新型可复制型广谱抗肿瘤双质粒DNA疫苗抑瘤活性的初步研究

王伟  
【摘要】:研究背景:继预防性疫苗之后,伴随着免疫学、分子生物学和细胞生物学的不断深入发展,近年来治疗性疫苗发展迅速。通过重新唤起机体对靶抗原的免疫应答能力,治疗性疫苗可以在患病个体诱导特异性免疫应答,清除病原体或异常细胞,使疾病得以治愈。治疗性疫苗已经成为防治恶性肿瘤术后复发转移的重要技术手段。由于DNA疫苗具有抗原性特异、应用安全及生产便捷的显著优点,作为一种特殊的高技术生物治疗药物,多种类型的DNA疫苗已经进入了临床前期及临床试验。针对恶性肿瘤治疗中的核心难题―免疫耐受‖,基于自主研发的可复制型DNA疫苗载体系统,本课题组开展了治疗性疫苗的免疫增效策略研究,并成功构建了新型双质粒可复制型抗肿瘤DNA疫苗。我们选择在多种实体肿瘤中广泛表达的两种肿瘤抗原HCG和Survivin,并选择与肿瘤血管新生关系密切的靶点VEGFR2,利用异种化抗原设计技术,构建了抗肿瘤多靶点异种同源基因复合抗原,可以有效打破肿瘤对自身抗原的免疫耐受,激活高效的细胞免疫和体液免疫反应,从而提高肿瘤临床治愈率。 研究目的:在实验室前期坚实的工作基础之上,构建由CAVA及CAVE组成的可复制型双质粒DNA疫苗,通过肌肉注射联合电脉冲的方法将得到的双质粒疫苗递送到小鼠体内,观察疫苗的抑瘤效果并对其可能的免疫学机制进行初步的探讨。 方法: 1.利用胰蛋白酶灌注消化法分离收集人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical VeinEndothelial Cells, HUVEC),进一步采用肿瘤细胞HepG2培养上清液诱导HUVEC向肿瘤源性内皮细胞(Tumor derived-Endothelial Cells, Td-EC)分化增殖。通过形态学观察和荧光标记Ⅷ因子相关抗原,鉴定血管内皮细胞;利用RT-PCR检测Td-EC中肿瘤血管内皮标志物(TEM)的表达。 2.将小鼠VEGFR2胞外1-4IgG样区域(mVEGFR2D1-4)及人β-hcg全长基因分别克隆到原核表达载体pET-42a中,将得到的原核表达质粒分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中并通过IPTG诱导表达,亲和层析法纯化融合蛋白,经SDS-PAGE分析,Western blot鉴定纯化后的目的蛋白,ELISA法检测纯化蛋白的抗原活性。 3.利用前期成功构建的质粒pVAX1-mVEGFR2-GFc-hIL12及可复制型载体系统PSVK,构建以异种化的mVEGFR2D1-4为靶抗原的可复制型DNA疫苗,命名为CAVE。 4.将DNA疫苗CAVE与前期构建好的CAVA采用电穿孔肌肉内注射的方式免疫小鼠,观察DNA疫苗的抑瘤效果,并对其相关的免疫学机制进行初步的研究:采用ELISA检测免疫小鼠血清中的特异抗体滴度和血清中的细胞因子的水平;采用ELISPOT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞特异性IFN-γ的分泌;采用海藻酸盐包裹肿瘤细胞移植物评价抗血管生成情况;对肿瘤组织进行CD31免疫组化染色观察疫苗免疫后肿瘤毛细血管密度。 结果: 1.成功分离得到了HUVEC,并将其诱导成为具有良好生物学活性的具有肿瘤源内皮细胞特性的Td-EC。 2.成功诱导并纯化出具有良好免疫原性的mVEGFR2D1-4/GST及人β-hcg/GST融合蛋白。 3.成功构建了可复制型DNA疫苗CAVE,并通过Western Blot检测证实了其体外真核表达。 4.观察联合应用与单独应用两种DNA疫苗免疫后的C57BL/6小鼠移植瘤生长趋势,发现与对照组相比疫苗免疫组小鼠肿瘤生长受到显著抑制,联合应用免疫组效果更为显著。疫苗免疫组小鼠血清内可检测到特异性抗Survivin、β-hcg及VEGFR2抗体,脾脏内可检测到特异性分泌IFN-γ的脾淋巴细胞;海藻酸盐包裹肿瘤细胞移植物实验及肿瘤组织CD31免疫组化检测证实CAVE能够显著抑制肿瘤组织毛细血管生成。 结论:本研究所构建的新型可复制型双质粒DNA疫苗与单独应用及对照组相比,在小鼠体内可以诱导产生更强的特异性细胞和体液免疫反应,能够抑制移植瘤的生长,为肿瘤的主动免疫治疗提供了一种新的选择。
【学位授予单位】:中国人民解放军医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R73-362

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前6条
1 蒋力;何勇;蒋耀光;;肿瘤源性血管内皮细胞的培养及其细胞生物学特性鉴定[J];重庆医学;2009年24期
2 张亮;阎瑾琦;王越;肖毅;高昆;董金凯;王博;于继云;;可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的构建及体内外表达[J];南方医科大学学报;2011年06期
3 董金凯;罗津;阎瑾琦;张亮;高江平;于继云;;小鼠前列腺干细胞抗原的原核表达、纯化及抗原活性检测[J];南方医科大学学报;2012年04期
4 孙慧琳;湛奕;刘珍珍;李筠;蔡德鸿;;人脐静脉内皮细胞的原代培养及鉴定[J];广东医学;2012年06期
5 金璐;赵玉伟;李知勉;赵成建;王晓飞;张凌;杨寒朔;;真核表达人和鼠可溶性VEGFR2的双基因疫苗的构建及抗肿瘤实验研究[J];四川大学学报(医学版);2010年04期
6 赵兴会;周晓光;赵霞;朱文秀;韩世愈;;恶性肿瘤中人绒毛膜促性腺激素β亚单位的研究进展[J];现代生物医学进展;2012年24期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 董微;许群星;韩玉环;尹利荣;;脐带血血清在脐静脉内皮细胞培养中的应用[J];重庆医学;2011年22期
2 董金凯;高江平;阎瑾琦;张亮;肖毅;王伟;王晓雄;于继云;;抗肿瘤免疫基因治疗剂pVAX-IL-12-GB的构建及体内外表达验证[J];南方医科大学学报;2012年06期
3 牛红心;吕文成;阎晓;;人脐静脉内皮细胞培养方法的改进及其优势[J];广东医学;2009年11期
4 夏宝妹;周怀君;;血管内皮生长因子家族与抗肿瘤血管生成[J];国际妇产科学杂志;2009年02期
5 杨海;王芳宇;;DNA疫苗的研究进展[J];中国畜牧兽医;2013年01期
6 王伟;殷小涛;李云奇;田仁礼;阎瑾琦;高江平;于继云;;小鼠VEGFR2胞外1-4IgG样结构域的原核表达、纯化及活性鉴定[J];南方医科大学学报;2013年01期
7 于婷;孙楠;刘艳;王玉梅;黄杰;曲守方;黄颖;;游离β-HCG定量标记免疫分析试剂盒行业标准的建立和验证[J];放射免疫学杂志;2013年04期
8 蒙玉刚;梁春燕;曾雅畅;;血管内皮生长因子家族及其受体在宫颈癌研究中的进展[J];广西医科大学学报;2013年04期
9 康从民;赵绪浩;于玉琪;吕英涛;;吲哚衍生物类VEGFR-2酪氨酸激酶抑制剂的从头设计[J];高等学校化学学报;2014年03期
10 陈东;张风林;;重组人内皮抑素对肺癌细胞H-52黏附和侵袭力的影响[J];贵阳中医学院学报;2013年06期
中国重要会议论文全文数据库 前2条
1 Chunhui LAI;Xia YU;Yuan XIE;Jian HE;Yi PENG;Sufang ZHOU;Xiaoxun XIE;Guorong LUO;Nuo ZHOU;Yongxiang ZHAO;Xiaoling LU;;Anti-tumor Immune Response of Folate-Conjugated Chitosan Nanoparticles Containing the IP-10 Gene in Mice with Hepatocellular Carcinoma[A];第十六届中国科协年会——分13感染、免疫和疫苗论坛论文集[C];2014年
2 Khoune Sodaly Mong;Nuo ZHOU;Jian HE;Siliang DUAN;Sufang ZHOU;Chunhui LAI;Xia YU;Yi PENG;Xiaoxun XIE;Guorong LUO;Yuan XIE;Yongxiang ZHAO;Xiaoling LU;;Folate-Modified Chitosan Nanoparticles Coating the Human IP-10 Gene Promote pMAGE-A1278-286 Specific CTL Responses to Hepatocellular Carcinoma in Mice[A];第十六届中国科协年会——分13感染、免疫和疫苗论坛论文集[C];2014年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王丽京;Slit-Robo信号在口腔癌形成中的功能研究[D];兰州大学;2008年
2 赵军;同种脑微血管内皮细胞疫苗诱导小鼠抗肺癌血管内皮细胞免疫效应研究[D];郑州大学;2009年
3 刘奎利;大鼠脐带来源间充质干细胞生物学特性及其对移植免疫耐受作用的研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2009年
4 雷晶;磁共振纳米铁颗粒成像技术在肿瘤及转移淋巴结中的基础实验研究[D];中国协和医科大学;2010年
5 张万福;胰岛素对烧伤早期内皮细胞功能紊乱的正性调节作用及分子机制[D];第四军医大学;2010年
6 杨巧慧;基于络病理论探讨VEGF、MVD、LVD与子宫内膜癌的相关性的研究[D];北京中医药大学;2013年
7 李阳;自分泌运动因子在胶质瘤干细胞中的作用及临床意义[D];大连医科大学;2012年
8 靳小雷;电脉冲介导的基因治疗影响兔髂骨贴附移植成骨的实验研究[D];北京协和医学院;2011年
9 赵东;天然高分子及多肽修饰的碳酸钙共沉淀基因及药物传递体系研究[D];武汉大学;2012年
10 唐帅;Eppin优势表位自组装纳米避孕疫苗的构建及实验研究[D];第三军医大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 杨静;KDR、TSP-1与宫颈鳞状细胞癌血管生成的关系[D];郑州大学;2010年
2 傅文达;As_2O_3联合重组Canstatin蛋白对血管内皮细胞影响的研究[D];石河子大学;2011年
3 王定淼;人脐静脉内皮细胞体外分离培养鉴定试验研究[D];华中科技大学;2010年
4 董平原;玻璃海鞘多肽PCI的分离纯化及其抗血管生成活性[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2007年
5 曹慧玲;脐带间质干细胞治疗肾脏缺血再灌注损伤的实验研究[D];江苏大学;2009年
6 杨萍;皮肤CD30+间变性大细胞淋巴瘤一例[D];浙江大学;2010年
7 王伟;免疫增效型广谱抗肿瘤血管生成基因疫苗的基础研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2010年
8 龚超群;脐带间充质干细胞对淋巴细胞的影响及淋巴细胞活化研究[D];暨南大学;2010年
9 古力热巴·夏依买旦;流体剪切应力作用强度对内皮细胞Fractalkine表达水平的影响[D];新疆医科大学;2012年
10 曹世姣;eIF4E和VEGF在子宫内膜异位症中的表达及相关性研究[D];南方医科大学;2012年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前6条
1 王昌青;杨兵;;DNA疫苗研究进展[J];中国畜牧兽医;2009年12期
2 任杰;高江平;阎瑾琦;江乐;于继云;;人前列腺干细胞抗原的原核表达、纯化及鉴定[J];解放军医学杂志;2010年08期
3 韩刚;于继云;高江平;;以PSCA为靶点的前列腺癌免疫治疗的研究进展[J];军医进修学院学报;2009年02期
4 刘长乐;郑心田;李广平;孟恒星;邱录贵;;体外人脐静脉内皮细胞的培养鉴定及抗原表达分析[J];山东医药;2011年36期
5 余云舟;孙志伟;刘志刚;俞炜源;;基于DNA的Semliki森林病毒复制子载体体内外高水平表达外源基因[J];生物化学与生物物理进展;2006年01期
6 王红仁;李明远;;基于甲病毒的RNA复制子疫苗[J];微生物学免疫学进展;2007年02期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 侯琳,张波;建立基于自主复制型载体的端粒酶转录调节细胞系[J];中华病理学杂志;2003年06期
2 温昌祥,吕群,项维;中华大蟾蜍染色体分带和姐妹染色单体互换的研究[J];遗传学报;1983年04期
3 王松;唐红;何芳;刘丽;黄飞骏;周陶友;赵连三;;肝富集转录因子在HBV基因转录与复制中的作用研究[J];四川大学学报(医学版);2006年01期
4 孔祥平;吴庆洲;罗显荣;胡莲美;李秀梅;易学瑞;佟明华;周军辉;刘光泽;;复制型HBV转基因小鼠遗传稳定性研究[J];中国生物工程杂志;2008年05期
5 侯全玲;唐红;何芳;刘丽;刘凤君;程星;何小燕;韩红霞;黄飞骏;;乙肝病毒X蛋白增强小鼠体内HBV的转录及复制[J];四川医学;2008年06期
6 左建民,徐葛林;用自身复制型RNA疫苗治疗癌症[J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;2000年06期
7 ;复制型HBV(adr)转基因小鼠模型的建立[J];肿瘤;1994年03期
8 ;复制型HBV(adr)转基因小鼠G_2、G_3代血清中HBV的表达──电镜检测[J];肿瘤;1995年05期
9 吴亚平,薛建祥;复制型HBV(adr)基因转基因小鼠模型研制成功[J];中华医学信息导报;1996年20期
10 董丽;;病毒的复制[J];科学之友;2010年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 李萍;朱家鸿;阮力;;以非复制型痘苗病毒为载体构建基因工程狂犬病疫苗的实验研究[A];面向21世纪的科技进步与社会经济发展(下册)[C];1999年
2 汤正好;余永胜;江红;奚敏;臧国庆;;非复制型腺病毒介导抗HBc ScFv细胞内表达和鉴定[A];中华医学会第十二次全国病毒性肝炎及肝病学术会议论文汇编[C];2005年
3 汤正好;余永胜;江红;奚敏;臧国庆;;非复制型腺病毒介导抗HBc ScFv细胞内表达和鉴定[A];中华医学会全国第九次感染病学学术会议论文汇编[C];2006年
4 王松;唐红;何芳;刘丽;黄飞骏;周陶友;赵连三;;肝富集转录因子在HBV基因转录与复制中的作用研究[A];第一次全国中西医结合传染病学术会议论文汇编[C];2006年
5 钱巧红;王晓飞;王喜忠;陈文元;王子淑;;绿臭蛙(Rana margaratae)复制带研究[A];中国细胞生物学学会第五次会议论文摘要汇编[C];1992年
6 朱荣;王震;张慧萍;黄海;凌玉琴;胡锡琪;翟为溶;王吉耀;朱虹光;;乙型肝炎病毒X基因的变异与原位病毒抗原的表达及病毒复制的相关性研究[A];中华医学会病理学分会2006年学术年会论文汇编[C];2006年
7 裘玮;李惠明;田毓华;黄倩;;条件复制型腺病毒辅助的腺相关病毒对大脑皮层神经元的转导[A];第九届全国肿瘤生物治疗学术会议论文集[C];2006年
8 于勐军;;专业口腔医院发展的护理管理模式[A];中华护理学会2009全国口腔科护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2009年
9 Femando Alonso;Carlos González;Luis Pastor;宋英杰;;协同设计:基于复制型数据库实现并行设计的途径[A];2007年CAD/CAM学术交流会议论文集[C];2007年
10 苏越;兰萍;肖庚富;胡宝利;肖巍;董长垣;齐义鹏;;一株重组单纯疱疹病毒的构建及其体外溶瘤试验[A];湖北省生物工程学会2004年年会学术报告及论文摘要汇编[C];2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 朱堂全;复制型经济[N];计算机世界;2002年
2 记者李明德;青海焙烤业由复制型走向开发型[N];中国食品报;2011年
3 金振蓉;艾滋病疫苗开始I期临床试验[N];光明日报;2007年
4 邹声文;我国复合型艾滋病疫苗开始Ⅰ期临床试验[N];医药经济报;2007年
5 记者 刘恕;我国艾滋病疫苗开始I期临床试验[N];科技日报;2007年
6 杨健;我国自主产权艾滋病疫苗开始I期临床试验[N];人民日报;2007年
7 孙芳华向利;我国艾滋病疫苗开始临床试验[N];中国知识产权报;2007年
8 本报记者 刘恕;“活疫苗”如何阻击艾滋病毒[N];科技日报;2007年
9 邵一鸣;国内外艾滋病疫苗的研究进展和发展趋势[N];人民政协报;2008年
10 郑灵巧;中国艾滋疫苗 走原创之路[N];健康报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王伟;新型可复制型广谱抗肿瘤双质粒DNA疫苗抑瘤活性的初步研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2013年
2 张亮;新型可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的抑瘤活性及免疫学机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年
3 管洁;丙型肝炎病毒新型疫苗的制备及免疫学评价[D];中国疾病预防控制中心;2011年
4 王梓华;携带外源基因的复制型HBV载体的构建[D];第三军医大学;2013年
5 曹明媚;庚型肝炎病毒作为复制型基因治疗载体及小干扰RNA对病毒表达复制抑制作用的研究[D];第二军医大学;2004年
6 苏加强;双特异性溶瘤腺病毒对人食管癌细胞EC-109的体内外抑制作用研究[D];吉林大学;2012年
7 齐荣;携带XAF1的复制型溶瘤腺病毒治疗恶性肿瘤的研究[D];上海交通大学;2008年
8 李霄;双特异性抗肿瘤重组腺病毒的构建、鉴定及实验免疫[D];吉林大学;2009年
9 邱松波;携带hTRAIL的复制型溶瘤腺病毒治疗恶性肿瘤的研究[D];武汉大学;2004年
10 许君;抗乙型肝炎病毒药物体外筛选评价体系的建立及绿茶提取物抗乙肝病毒研究[D];中国科学院研究生院(武汉病毒研究所);2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王宇;可复制型甲病毒颗粒疫苗的制备及其DC靶向化初步实验研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年
2 刘国栋;DNA载体pVAX1-IRES和复制型DNA载体pSFVax1-IRES的构建及表达[D];曲阜师范大学;2007年
3 王秋景;胞质内DNA识别蛋白在HBV复制中的作用[D];华中科技大学;2012年
4 任杰;抗前列腺癌可复制型DNA疫苗pSCK-PSCA3的基础研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2010年
5 李小月;一株呼吸道合胞病毒融合糖蛋白F和EGFP共表达的非复制型腺病毒重组体的构建、鉴定及表达[D];安徽医科大学;2005年
6 孙会来;人免疫缺陷病毒重组非复制型痘苗病毒的构建及其免疫原性研究[D];吉林大学;2007年
7 何世海;共表达骨保护素和碱性成纤维细胞生长因子非复制型重组腺病毒治疗牙槽骨缺损的实验研究[D];安徽医科大学;2011年
8 郑洪玲;基于甲病毒复制子的核酸疫苗的构建及实验免疫研究[D];吉林大学;2007年
9 龙驹;携带IL-18的复制型溶瘤腺病毒治疗肝癌的研究[D];西北农林科技大学;2007年
10 李盼;乙肝可复制型DNA疫苗低电压电穿孔递送与免疫活性研究[D];新疆大学;2013年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026