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《中国人民解放军医学院》 2014年
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汉族人群中醛固酮瘤患者基因突变的研究

李新涛  
【摘要】:目的:最近研究表明醛固酮瘤中发生的散发性和遗传性突变在该疾病发病机制中发挥重要的作用,目前发现的突变基因包括KCNJ5,ATP1A1,ATP2B3和CACNA1D。但目前在国内关于这些基因的突变尚无大样本量的研究。本实验主要研究上述基因在汉族人群醛固酮瘤中的突变和表达情况,并分析突变与病人临床表型之间的关系,为临床诊断和治疗提供新的依据。方法:1.提取114例APA组织DNA,其中87例APA组织的RNA和外周血DNA,将RNA逆转为cDNA,将DNA以及cDNA经PCR扩增后对目标基因进行测序,以检测组织中各基因的突变情况,并分析各基因突变情况与临床表型的关系;2.采用RT-PCR和免疫组织化学方法检测APA组织中KCNJ5基因的mRNA和蛋白的表达;3.对于新发现的两种KCNJ5突变在HEK293和H295R细胞系中进行功能验证,通过MTS方法检测细胞增殖;使用DiSBAC2荧光染料检测细胞膜电位,醛固酮放射免疫分析试剂盒检测醛固酮浓度,RT-PCR检测相关基因表达。结果:1.114例APA病人中86例病人存在有KCNJ5基因的突变(75.44%),这些突变包括已经报道的G151R,L168R和T158A,还有两个尚未报道的新突变,一个同时存在E147Q点突变和9个碱基的插入突变,另一个病人为36个碱基的重复突变,即G153_G164dup。ATP1A1和ATP2B3基因并没有检测到突变,仅有一个病人检测到有CACNA1D基因的突变(V748I),该突变也尚未报道。2.与国外其他研究相比,本研究中男性APA病人与女性病人有较相似的KCNJ5基因突变率(75.47%对74.19%)。相对未突变的患者,KCNJ5基因突变的APA患者有较高的术前收缩压和血醛固酮浓度,较低的术前血钾,对体位试验反应更不敏感。3.RT-PCR结果显示KCNJ5基因和CYP11B2基因的mRNA表达在突变的APA组织中更高。免疫组织化学结果显示发生KCNJ5基因突变的醛固酮瘤组织KCNJ5蛋白的染色异质性更大;未发生该基因突变的醛固酮瘤组织也有染色,但各部分组织染色一致性较好;无功能腺瘤中KCNJ5蛋白的染色呈阴性。4.将表达两种KCNJ5新突变的质粒转入HEK293细胞中后可导致细胞增殖减低,在荧光显微镜下观察,使用染料DiSBAC2后显示转染两种突变型质粒后的细胞更多荧光染料进入细胞内,说明细胞膜电位发生了去极化;将表达两种KCNJ5新发突变的质粒转入H295R细胞后,KCNJ5-M1(同时存在点突变及插入突变)和KCNJ5-M2(重复突变)分别使醛固酮分泌增加了2.27倍和2.10倍,加入血管紧张素II刺激24小时后两种质粒分别使醛固酮分泌增加了1.40倍和1.34倍。结论:1.KCNJ5基因在汉族人群醛固酮瘤患者中突变率较国外高,未发现有ATP1A1和ATP2B3基因突变;2.男性APA病人KCNJ5基因突变率与女性病人相似;3.KCNJ5基因和CYP11B2基因在KCNJ5突变的APA病人肿瘤组织中mRNA表达更高,而KCNJ5蛋白在突变肿瘤组织中表达不均一,无突变肿瘤组织中表达均一,而在无功能腺瘤中未染色;4.两种新发现KCNJ5突变类型可以导致细胞增殖减低、细胞膜电位去极化、醛固酮分泌及相关基因表达的增加。
【学位授予单位】:中国人民解放军医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R586.24

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【参考文献】
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【共引文献】
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