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《中国人民解放军医学院》 2016年
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掺锶丝素蛋白纳米纤维材料的研制及其用于膜引导骨再生的实验研究

陆史俊  
【摘要】:随着种植牙技术的普及及相关材料学、再生医学的发展,种植牙已成为缺牙修复的首选方式。然而,重建缺牙区域的牙槽骨组织,提高种植修复的长期成功率和美观效果,仍然是临床治疗中亟待解决的难题。引导骨再生技术是解决这一难题最常用、最有效的方法之一,该技术的关键在于通过使用屏障膜物理性地阻隔软组织与骨缺损区域,给骨缺损区域创建一个相对稳定的骨再生空间,保护生长且迁移速度较慢的前体成骨细胞进入骨缺损区,达到缺损区骨质的修复性再生。胶原膜是一种最为常见的生物屏障膜材料,然而良好的生物相容性并不能弥补其力学性能低、骨诱导能力不足等缺陷。丝素蛋白作为一种新型的生物医用材料,具有良好的生物相容性、优异的力学性能以及可控的降解性和可塑性,已被广泛用于骨组织工程领域的研究。近年来,锶作为一种新型的骨诱导元素,被证实对骨代谢具有双向调节作用,有利于骨组织的修复再生。本研究中,我们以丝素蛋白材料为主体,采用静电纺丝技术构建含锶元素的仿生丝素蛋白生物膜,系统地对材料的理化特性进行表征,研究材料对于骨髓间充质干细胞粘附、增殖及成骨向分化的影响,并通过动物实验进一步验证材料用于膜引导骨再生的可行性,为新型引导骨再生生物膜的优化及开发提供参考。第一部分 改良丝素蛋白纳米纤维膜的制备及其用于修复大鼠颅骨缺损的效果评价目的:研究采用新型酸盐溶解体系及静电纺丝技术制备的改良纯丝素蛋白膜的理化特性,并将其用于大鼠颅骨缺损的修复治疗,探讨将这种丝素蛋白膜代替引导骨再生膜的可行性。方法:1.本实验在前期研究的基础上,使用新型的溴化锂-甲酸溶解体系溶解蚕丝,利于静电纺丝技术制备丝素蛋白纳米纤维膜。2.利于扫描电子纤维镜观察材料的形貌特征,红外光谱仪分析材料的结构成分,万能力学试验机测试材料的力学性能。3.将丝素蛋白纳米纤维膜与Bio-gide(?)胶原膜分别植入大鼠颅骨缺损模型,采用Micro-CT检测、HE染色及Ⅰ型胶原免疫组织化学染色评估术后4周与12周时的骨缺损修复情况。结果:1.丝素蛋白膜由随机取向的纳米纤维组成,纤维直径为200-600纳米,该丝素蛋白膜的力学性能要优于胶原膜。2.大鼠颅骨缺损修复实验结果显示:术后4周时,丝素蛋白膜的引导骨再生效果优于胶原膜;术后12周时,两组骨修复均已接近完成。结论:在本部分实验中,我们使用静电纺丝技术配合新型的蚕丝溶解体系,成功制备了具有良好力学性能的丝素蛋白纳米纤维膜,该膜具有良好的生物相容性、定的骨引导再生能力及与骨再生相适应的降解速率,同时丝素蛋白材料来源广泛、价格适中,可以作为制备引导骨再生膜的潜在替代材料。第二部分 氯化锶/丝素蛋白纳米纤维膜的制备及其用于膜引导骨再生的实验研究目的:在第一部分实验的基础上,尝试将骨诱导元素锶引入丝素蛋白纳米纤维膜中,制备氯化锶/丝素蛋白纳米纤维膜,表征膜材料的理化性能,研究其对于大鼠骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响,通过动物实验验证其用于引导骨再生膜的可行性。方法:1.在对丝素蛋白溶液进行静电纺丝的过程中加入氯化锶溶液,制成氯化锶/丝素蛋白纳米纤维膜。2.扫描电子显微镜观察材料的形貌特征,X射线衍射仪及X射线光电子能谱仪分析材料的结构组成,浸提实验检测材料中锶离子的释放曲线。3.体外大鼠全骨髓贴壁法分离培养间充质干细胞,进行细胞分子表型及成骨、成脂向分化鉴定。4.将大鼠骨髓间充质干细胞与材料共培养,通过扫描电镜观察及CCK-8检测细胞的增殖、粘附情况。5.对与材料共培养的细胞进行成骨诱导,通过碱性磷酸酶活性检测细胞的骨向分化。6.将氯化锶/丝素蛋白膜材料植入大鼠颅骨缺损模型,并与纯丝素膜及空白组作对照研究,采用Micro-CT检测、HE染色及Ⅰ型胶原免疫组织化学染色评估术后6周时的骨缺损修复情况。结果:1.本实验制得含氯化锶质量分数为1%、5%、10%的氯化锶/丝素蛋白纳米纤维膜,膜材料的外观与纯丝素蛋白膜无明显差异,纳米纤维直径随氯化锶含量的增加而增大,三组材料在早期均有锶离子的快速释放。2.骨髓间充质干细胞在氯化锶/丝素蛋白膜表面粘附数量明显增多,细胞增殖活性及碱性磷酸酶活性也高于纯丝素蛋白膜组,并且具有一定的浓度依赖性。3.选取10%氯化锶/丝素蛋白膜用于大鼠颅骨缺损模型的修复治疗,结果显示该膜具有更理想的引导骨再生效果。结论:在本部分实验中,我们首次制备了氯化锶/丝素蛋白纳米纤维膜,该新型膜材料具有良好的生物相容性,一定的锶离子缓释作用,更优异的骨诱导再生能力及与骨再生相适应的降解速率。基于上述结果,我们认为这种氯化锶/丝素蛋白纳米纤维膜是一种理想的引导骨再生膜替代材料。第三部分 基于生物矿化的碳酸锶/丝素蛋白纳米纤维膜的构建及其对于骨髓间充质干细胞增殖与分化的影响目的:在第二部分实验的基础上,我们以丝素蛋白生物大分子为模板,尝试通过生物矿化的方法将氯化锶/丝素蛋白纳米纤维中的氯化锶转变为溶解度更低的碳酸锶,以期改善氯化锶/丝素蛋白膜早期的“爆释”现象,获得碳酸锶/丝素蛋白纳米纤维膜,表征材料的形貌特征、碳酸锶结晶形态及锶离子的释放量,并进一步分析其对于骨髓间充质干细胞增殖及骨向分化的影响。方法:1.在第二部分实验的基础上,选取10%氯化锶/丝素蛋白纳米纤维膜为原料,通过气相扩散生物矿化的方法制备成碳酸锶/丝素蛋白纳米纤维膜2.扫描电子显微镜观察材料的形貌特征,X射线衍射仪分析材料的组成结构,浸提实验检测材料中锶离子的释放曲线。3.将大鼠骨髓间充质干细胞与材料共培养,通过扫描电镜观察及CCK-8检测细胞的增殖、粘附情况。4.对与材料共培养的细胞进行成骨诱导,检测碱性磷酸酶活性,并通过实时荧光定量PCR的方法检测细胞成骨向分化相关基因RUNX2、BSP、OCN的表达情况。结果:1.本实验制得碳酸锶/丝素蛋白纳米纤维膜,膜外观较矿化前粗糙,平整度稍差。电镜显示材料纳米纤维表面出现许多纳米碳酸锶颗粒,分布均匀。该材料中锶离子的释放量及释放速率较氯化锶/丝素蛋白膜明显降低。2.骨髓间充质干细胞在碳酸锶/丝素蛋白表面能形成良好的早期粘附,并不断增值,细胞表面早期即分泌出现颗粒样细胞外基质。3.相较于纯丝素蛋白膜,掺锶的丝素蛋白膜能明显促进骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性,同时上调成骨向分化基因的表达;并且碳酸锶/丝素蛋白材料的促成骨向分化作用更为明显。结论:在本部分实验中,我们采用生物矿化的方法成功制成含纳米碳酸锶颗粒的丝素蛋白纳米纤维膜,该新型材料具有稳定的锶离子缓释作用,良好的生物相容性,能更好地促进间充质干细胞的粘附增殖及骨向分化。在后续实验中,我们需要通过体内实验进一步研究材料的生物学性能及骨引导性,以满足骨组织工程的需要。
【学位授予单位】:中国人民解放军医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R783.1

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