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《中国人民解放军医学院》 2017年
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干细胞对人皮肤组织修复再生作用及关键调控因子的研究

李倩坤  
【摘要】:目的:探究干细胞对皮肤修复与再生作用及关键调控因子。一方面,观察间充质干细胞(MSCs)的培养基对光老化表皮细胞的修复再生作用,研究有效分泌因子及其作用机制,为皮肤抗老化及去分化提供新的方法。另一方面,在前期研究的基础上,利用去分化源性表皮干细胞对人配对盒(Pairedbox6,Pax6)基因DNA甲基化调节在汗腺再生过程中的关键作用进行验证,并对汗腺样细胞进行安全性评价,进一步分析关键调控因子诱导汗腺再生的作用机制。方法:利用定量紫外线照射人永生化表皮细胞(HaCaT)构建表皮细胞光老化模型,培养人绒毛膜间充质干细胞(CDSCs),将不同浓度的人绒毛膜间充质干细胞上清液(CDSC-CNM)作用光老化表皮细胞,通过细胞迁移、荧光探针、彗星分析实验等测定细胞增殖、活性氧自由基(radical oxygen species, ROS)生成量、DNA损伤的变化,观察其抗老化修复再生作用;检测有效分泌因子,并通过Western blot测定相关通路蛋白,分析其作用机制。构建Pax6真核表达载体,培养去分化源性表皮干细胞,设置实验分组。将Pax6质粒转染至去分化源性表皮干细胞并通过G418筛选稳定表达细胞系,加入甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC)继续培养,利用Realtime-PCR检测Pax6的mRNA表达情况,应用免疫荧光法检测C E A、C K7等汗腺标志物,并进行裸鼠脚掌汗腺移植再生的验证及安全性评价。结果:成功构建了人表皮细胞光老化模型,一定浓度的CDSC-CNM对光老化表皮细胞有修复再生作用,可以有效增强细胞活力、减少ROS生成量并减轻DNA损伤程度。CDSC培养基检测发现,表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、白介素-6 (IL-6)及IL-8可能为有效的分泌因子,并通过JAK/STAT、MAPK等信号通路机制发挥作用。构建了 Pax6真核质粒,转染Pax6质粒的去分化源性表皮干细胞经过G418筛选后形成阳性克隆,Realtime-PCR及Western blot结果显示,Pax6+5-Aza-dC组细胞中CEA、CK7的mRNA及蛋白均有表达,免疫荧光染色结果显示,Pax6+5-Aza-dC组细胞的CEA、CK7蛋白呈阳性表达。碘淀粉发汗实验结果显示,大约7/10使用Pax6+5-Aza-dC组细胞进行脚掌移植的裸鼠可见阳性结果,组织学检查发现,HE染色切片中Pax6+5-Aza-dC组可见再生的汗腺结构,皮肤基底层部位的汗腺导管相互连接,而对照组则没有发现类似汗腺的结构。接种汗腺样(SGL)细胞的实验组接种处没有出现肿物,接种胃癌(MGC-803)细胞的对照组三周(w)后显示背部肿物,组织切片观察,实验组的组织中未见异常或肿瘤细胞而对照可见大量异型肿瘤细胞组织。结论:人绒毛膜间充质干细胞上清液对人光老化表皮细胞具有修复再生作用,其中b-FGF、EGF、TGF-β、IL-6及IL-8等细胞分泌因子发挥着关键作用,这为皮肤抗老化的预防治疗提供了新的方法,也为表皮细胞去分化提供了诱导条件。Pax6和5-Aza-dC共同作用可以促使去分化源性表皮干细胞转化为SGL细胞,并表达出CEA、CK7等汗腺特异性标志物,验证了 SGL细胞在裸鼠模型中的生物学功能,移植瘤实验证明了 SGL细胞的安全性,为临床大面积汗腺损伤的患者实现汗腺再生带来希望。通过深入探讨Pax6甲基化调控机制,汗腺再生的理论体系将进一步得到完善。
【学位授予单位】:中国人民解放军医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R64

【参考文献】
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