Wnt信号通路对增龄性骨质疏松条件下颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化的调控机制研究

【摘要】：口腔种植修复是治疗牙缺失的首选方案,而骨结合是种植成功的关键因素。增龄性骨质疏松引起的骨结合不佳已成为困扰老年人牙种植的严重问题。间充质干细胞是组织再生的基础,但不同组织来源功能存在差异。我们前期已成功从颌骨获得骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs),并证实颌骨骨髓间充质干细胞(jaw bone marrowmesenchymal stem cells,JBMMSCs)的牙槽骨原位成骨能力显著强于髂骨来源的BMMSCs,且Wnt信号通路在成骨过程中作用显著。但衰老性骨质疏松中Wnt信号通路在JBMMSCs成骨分化及骨再生能力改变方面发挥作用的分子机制和作用规律尚不清楚,因此,本实验拟探究衰老性骨质疏松条件下JBMMSCs生物学行为的改变,阐明自然衰老骨质疏松条件下Wnt信号通路在JBMMSCs成骨分化中的调控机制和规律。目的:1.建立衰老性骨质疏松大鼠模型。2.分离并提取自然衰老大鼠的颌骨骨髓间充质干细胞。3.探讨衰老性骨质疏松条件下JBMMSCs生物学功能的改变。4.初步探索Wnt信号通路对衰老性骨质疏松条件下JBMMSCs成骨分化的调控规律。方法:1对20月龄大鼠和2月龄大鼠(各20只,均为雄性)进行Micro-CT扫描检测骨密度、骨小梁数目、骨小梁间隙等相关指标,扫描完成后,进行组织重建和数据分析,定量分析股骨干骺端和颌骨骨髓腔骨小梁参数:骨密度值、骨小梁数目、骨小梁分离度等相关数据,对比确定模型是否建立成功。2.取年轻和衰老大鼠的股骨和颌骨进行切片,进行HE染色观察组织病理情况。3.采用贴壁法培养JBMMSCs,并利用流式细胞术对干细胞表面分子进行鉴定4.CCK8法检测年经和衰老JBMMSCs的细胞增殖能力;流式细胞术检测年轻和衰老JBMMSCs的细胞周期和凋亡水平;采用碱性磷酸酶染色、茜素红染色、油红O染色法检测年经和衰老JBMMSCs的成骨及成脂分化能力。5.利用Real-Time PCR法和Westemblot实验技术检测年轻和衰老JBMMSCs中Wnt信号通路相关分子及成骨相关基因和蛋白(Wnt3a、Wnt4、β-catenin、GSK-3β、TCF4、LEF1、RUNX-2、COL-1、OCN、BSP 等)的表达量。结果:1.衰老组颌骨和股骨骨密度、骨小梁数目均明显低于年轻组;而骨小梁间距明显大于年轻组,两组间各参数相比,差异均有统计学意义(P0.05),且HE切片染色结果显示,衰老组颌骨及股骨骨髓腔较年轻组明显脂肪化。2.我们成功从2月龄大鼠和20月龄大鼠颌骨分离出了 JBMMSCs,衰老组JBMMSCs形态较年轻组JBMMSCs扁平,且JBMMSCs阳性表达CD29,CD90,阴性表达造血干细胞表面标记CD34,CD45,符合间充质干细胞特性。3.克隆形成实验结果显示,年轻组形成的克隆堆数为909.33±21.20,克隆形成率为18.19±0.42%,衰老组组形成克隆堆数为299.33±41.18,克隆形成率为5.99±0.83%,衰老组JBMMSCs克隆形成能力弱于年轻组,差异有统计学意义(P0.05)。4.CCK8实验结果显示,培养后7d各时间点,两组OD值相比,从培养后3-7天差异均有统计学意义(P0.05)。5.流式周期检测结果显示,衰老组G0G1期细胞比例高于年轻组,而S期细胞比例低于年轻组,表明衰老组JBMMSCs增殖能力下降;流式凋亡结果显示,衰老组凋亡水平高于年轻组,且差异显著(P0.05)。6.成骨诱导ALP染色结果和茜素红染色结果显示,衰老组形成的蓝色沉淀及矿化结节均低于年轻组,成脂诱导后油红O染色结果显示,衰老组形成的脂滴数量明显多于年轻组。7.实时定量PCR检测结果显示,衰老组成骨诱导7天后成骨相关基因RUNX-2、OCN、COL-1、BSP表达量低于年轻组。8.Westemblot进一步证实成骨诱导后,两组成骨关键蛋白RUNX2、OCN均较对照组明显升高,但成骨诱导后,与年轻组相比,衰老组RUNX2、OCN的蛋白表达量降低。9.PCR检测结果显示,衰老组Wnt信号通路相关分子β-catenin、Wnt3a、TCF-4基因的表达量较年轻组明显降低,Wnt4、GSK3β、LEF-1基因的表达量变化不显著。1 0.Westemblot检测结果显示,衰老组Wnt信号通路关键分子p-β-catenin蛋白的表达量较年轻组明显下降。结论:1、20月龄大鼠出现了明显的骨质疏松症状,主要表现在股骨和颌骨骨密度和骨小梁数目下降,而骨小梁分离度增加,骨髓腔脂肪化,衰老性骨质疏松大鼠模型建立成功。2、衰老性骨质疏松条件下JBMMSCs的生物学功能发生明显改变,主要表现在JBMMSCs自我更新能力、增殖能力、成骨分化能力下降。3、衰老性骨质疏松条件下,Wnt信号通路相关分子Wnt3a、β-catenin、TCF4表达降低,可能是JBMMSCs生物学行为改变的重要原因。