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《中国人民解放军医学院》 2019年
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FXR对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应及小鼠肠道屏障损伤的作用研究

李淑玲  
【摘要】:目的:研究胆汁酸核受体(法尼醇衍生物X受体,Farnesoid X Receptor,FXR)对脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导的巨噬细胞炎症反应的影响及对小鼠肠道黏膜屏障损伤的作用,并对作用机制进行初步探讨。本课题拟从三部分进行研究:(1)观察FXR基因敲除对LPS诱导的内毒素血症模型中小鼠的存活率及各个器官损伤的情况,明确FXR基因对急性炎症反应的影响。(2)研究FXR激动剂GW4064对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子的分泌及表达,NO生成和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响,并对机制进行初步的探讨。(3)观察FXR激动剂奥贝胆酸(OCA)对LPS诱导的小鼠肠道损伤的影响,并对相关的机制进行探讨。方法:(1)A:雄性FXR基因敲除(FXR-/-)和野生型(WT)C57BL/6小鼠各10只,采用LPS(30mg/kg)腹腔注射,观察两组小鼠的生存情况;B:雄性FXR-/-和WTC57BL/6小鼠各6只,采用LPS(10mg/kg)腹腔注射,通过血生化检测两组小鼠的肝肾功能,ELISA检测血清炎症因子的分泌,HE染色观察肠、肺的组织病理学损伤。(2)不同浓度的FXR激动剂GW4064处理RAW264.7巨噬细胞,给予LPS(1μg/ml)刺激后,通过流式高通量多因子检测技术和Griess法分别检测炎症因子TNF-α,MCP-1和NO的分泌;采用qPCR技术检测炎症因子IL-1β,TNF-α和iNOS的mRNA的表达;Western blot检测iNOS及NF-κB蛋白的表达水平。(3)雄性WTC57BL/6小鼠32只,随机分为对照组(Control,n=8),内毒素血症组(LPS,n=8),奥贝胆酸灌胃组(OCA,n=8),奥贝胆酸灌胃+内毒素血症组(OCA+LPS,n=8),通过腹腔注射10mg/kg的LPS建立内毒素血症模型,在3注射LPS前的48h,24h,6h对小鼠给予10mg/kg的奥贝胆酸灌胃处理,于LPS腹腔注射24h后麻醉处死小鼠,收集近端空肠和远端回肠标本行组织病理学分析,并通过实时荧光定量PCR检测RNA的表达,通过免疫组化、Western blot和免疫荧光技术检测蛋白的表达及分布,并探讨可能的作用机制。结果:(1)小鼠的生存曲线分析显示FXR基因敲除明显增加LPS诱导的小鼠死亡率(P0.05),FXR-/-组小鼠血清肝功能AST、ALT,肾功能BUN均显著高于WT组小鼠(P0.05),且小鼠的肺和肠道损伤更为严重,血清中促炎因子IL-1β水平明显高于WT组小鼠,而抗炎因子IL-10浓度明显低于WT组小鼠(P0.05)。(2)FXR激动剂GW4064能抑制LPS诱导的细胞促炎因子IL-1β,TNF-α和iNOS的mRNA的表达(P0.05),同时能不同程度的抑制细胞上清中TNF-α,MCP-1的分泌量(P0.05),并且呈剂量依赖性的抑制NO的释放(P0.05);除此之外,GW4064(10、20 μmol/L)可显著抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞iNOS蛋白的产生(P0.01),经过GW4064处理后,LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NF-κB的活性也显著下调(P0.01)。(3)与LPS组相比,奥贝胆酸处理可提高内毒素血症小鼠临床症状评分(P0.05)和小肠病理评分(P0.05);相应的,奥贝胆酸可减少肠道异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖的渗漏,显著改善内毒素血症小鼠肠道的通透性(P0.01),并可恢复小鼠肠道中由LPS诱导的ZO-1(P0.05)和Occludin蛋白的表达(P0.01),并且抑制回肠组织中TLR4蛋白的表达和TLR4、MyD88 mRNA的表达(P0.05),进一步研究发现奥贝胆酸还可抑制内毒素血症小鼠肠道NF-κB信号途径的激活(P0.05)。结论:(1)FXR激动剂GW4064可抑制LPS诱导的巨噬细胞急性炎症反应,发挥其抗炎作用,抑制iNOS的表达及下调NF-κB的活性是其发挥抗炎作用的机制之一。(2)FXR基因敲除可明显加重LPS导致的小鼠多器官损伤,而FXR激动剂奥贝胆酸可缓解LPS诱导的小鼠肠道黏膜屏障的损伤,奥贝胆酸可能通过抑制TLR4/NF-κB信号途径的激活而发挥其肠道黏膜保护作用。
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