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PRSS1~(R122H)突变介导胰蛋白酶活化在急性胰腺炎中的致病作用及其机制研究

姚瑶  
【摘要】:急性胰腺炎是一种发病率和死亡率极高的胰腺炎症疾病,急性胰腺炎的危险因素主要包括暴饮暴食、酗酒、胆道结石、先天性遗传疾病等。目前已经发现一部分胰腺先天性遗传疾病患者通常携带阳离子胰蛋白酶原基因,即PRSS1基因的点突变,但是该基因突变与急性胰腺炎之间的关系仍不清楚。为了进一步研究该突变基因在急性胰腺炎发生发展过程中的作用及机制,我们利用细菌人工染色体转基因技术繁育出了携带点突变的PRSS1~(R122H)转基因小鼠,并且该基因能够在子代鼠体内稳定传代、表达,我们首先检测了该转基因小鼠的基因型,探究了该小鼠的表型,建立了更加稳定、典型的雨蛙素诱导急性胰腺炎的疾病模型,发现PRSS1~(R122H)突变增加腺泡细胞对雨蛙素的敏感性;并阐述了PRSS1突变能够介导胰蛋白酶的活化,在急性胰腺炎的发展过程中,胰蛋白酶的持续作用促进了腺泡细胞凋亡、腺泡导管上皮化生(acinoductal metaplasia,ADM)、星状细胞活化等慢性纤维化改变,而胰蛋白酶抑制剂可在一定程度上减轻胰腺的萎缩,腺泡细胞的凋亡和慢性纤维化的进程,改善胰腺炎的预后。揭示了PRSS1突变介导的胰蛋白酶活化、腺泡细胞凋亡与急性胰腺炎之间相互关系,为进一步探究急性胰腺炎的发生机制和临床治疗提供了更加有力的依据。第一部分PRSS1~(R122H)转基因小鼠的基因型及其表型的鉴定目的:利用细菌人工染色体技术构建携带PRSS1~(R122H)点突变基因片段的质粒,并使该基因在子代小鼠体内得到稳定的传代和表达。对子代鼠的基因型进行鉴定,并初步探究PRSS1~(R122H)转基因小鼠的表型。材料和方法:利用细菌人工染色体技术构建携带PRSS1~(R122H)点突变基因片段的质粒,并通过显微注射法将其转染至小鼠体内,进行后代繁殖,使该基因在子代小鼠体内得到稳定的传代和表达。以C57BL/6J小鼠为对照,我们用鼠尾鉴定法提取转基因小鼠的基因组DNA,应用琼脂糖凝胶电泳鉴定了基因型。观察并比较不同周龄(6周、35周和50周)的C57BL/6J小鼠和PRSS1~(R122H)转基因小鼠的外观和行为学表现,定期记录体重变化。收集不同周龄的C57BL/6J小鼠和PRSS1~(R122H)转基因小鼠的胰腺组织,观察比较胰腺组织的HE染色病理学特征。结果:鼠尾基因鉴定法结果证实小鼠的基因型为PRSS1~(R122H)。PRSS1~(R122H)转基因小鼠在6周、35周和50周龄时的外观、行为、发育特征、体重变化均与C57BL/6J小鼠无明显差异,胰腺组织HE染色无水肿、坏死、出血等典型的炎症病理改变,50周龄时未观察到自发性胰腺炎的病理改变。结论:PRSS1~(R122H)转基因小鼠在不同周龄时的外观、行为、发育特征、体重变化、胰腺组织病理学特征均与C57BL/6J小鼠无明显差异,且在50周龄以前无自发性胰腺炎。第二部分PRSS1~(R122H)基因对建立急性胰腺炎小鼠疾病模型的影响目的:探究PRSS1~(R122H)突变对L-Arginine和雨蛙素诱导建立急性胰腺炎小鼠疾病模型的影响,研究PRSS1~(R122H)突变对腺泡细胞的雨蛙素敏感性的作用。材料和方法:分别采用较为常用的腹腔注射L-Arginine诱导法和雨蛙素诱导法建立急性胰腺炎疾病模型,于24小时后处死小鼠。通过对小鼠行为学的观察、胰腺/体重比的计算、血清淀粉酶水平的测定及组织学HE病理染色的结果指标,根据胰腺组织的水肿程度、出血、坏死、炎症细胞浸润水平等观察指标进行病理评分。用免疫组织化学染色法检测CD11b和F4/80的表达水平,进一步评估炎症细胞浸润的情况。配制不同浓度梯度的雨蛙素溶液(1.25ug/kg、2.5ug/kg、5ug/kg、7.5ug/kg、10ug/kg、12.5ug/kg、15.0 ug/kg),分别建立C57BL/6J小鼠和PRSS1~(R122H)转基因小鼠的急性胰腺炎模型,通过胰腺/体重比的计算、血清淀粉酶水平的测定及组织学HE病理染色结果的比较,得出诱发急性胰腺炎的最低浓度的数据。结果:腹腔注射L-Arginine诱导法建立的PRSS1~(R122H)转基因小鼠的急性胰腺炎模型炎症程度较轻,与C57BL/6J小鼠无显著差异。雨蛙素诱导法建立的急性胰腺炎疾病模型中,PRSS1~(R122H)转基因小鼠的行为学变化明显,其胰腺/体重比、血清淀粉酶水平和HE组织病理学染色评分均显著高于C57BL/6J小鼠。免疫组织化学染色显示F4/80和CD11b在PRSS1~(R122H)转基因小鼠胰腺组织中的表达水平明显高于C57BL/6J小鼠。当雨蛙素浓度达到12.5ug/kg时,PRSS1~(R122H)转基因小鼠即可出现急性胰腺炎的典型表现,包括胰腺/体重比、血清淀粉酶水平,HE染色病理评分均显著高于C57BL/6J小鼠,病理表现主要包括腺泡细胞水肿、坏死、出血、炎症细胞浸润等。结论:PRSS1~(R122H)突变有助于建立更加典型、稳定的雨蛙素诱导后的急性胰腺炎疾病模型,PRSS1~(R122H)突变增加了小鼠的胰腺腺泡细胞对雨蛙素的敏感性。第三部分PRSS1~(R122H)突变介导胰蛋白酶活化对急性胰腺炎的作用及机制研究目的:探究PRSS1~(R122H)突变介导胰蛋白酶活化在急性胰腺炎发生发展过程中的作用,使用胰蛋白酶抑制剂对PRSS1~(R122H)转基因小鼠急性胰腺炎的作用及具体机制。材料和方法:通过腹腔注射雨蛙素诱导法建立急性胰腺炎疾病模型,将小鼠随机分为对照组(n=20)、急性胰腺炎造模24小时组(n=20)、急性胰腺炎造模72小时组(n=20)和胰蛋白酶抑制剂治疗组(n=20)。首先将急性胰腺炎造模24小时组和72小时组进行了胰腺组织的HE染色,比较两组之间胰腺腺泡细胞的数量和水肿、出血、凋亡、炎症细胞浸润、纤维化等病理特征;随后进行了TUNEL凋亡信号的检测和比较。为了进一步证实PRSS1~(R122H)突变介导胰蛋白酶活化与细胞凋亡途径的关系,我们使用了胰蛋白酶抑制剂,观察并记录了抑制胰蛋白酶24小时和72小时之后小鼠行为学的变化、胰腺/体重比、血清淀粉酶水平和组织学HE病理染色结果,用免疫组织化学染色法检测了α-SMA和C-Caspase3的表达水平,用免疫荧光染色法评估了TUNEL凋亡信号的表达水平。结果:PRSS1~(R122H)突变能够介导小鼠腺泡细胞内胰蛋白酶活性的显著提高。雨蛙素刺激24小时后,PRSS1~(R122H)转基因小鼠的表现为血清淀粉酶升高,HE染色显示为细胞水肿、出血、坏死、炎症细胞浸润等急性胰腺炎的典型病理表现。使用胰蛋白酶抑制剂后血清淀粉酶下降,细胞水肿、出血、坏死、炎症细胞浸润等病理表现明显减轻。当胰蛋白酶持续激活72小时后,胰腺/体重比显著下降,HE染色显示PRSS1~(R122H)转基因小鼠的腺泡细胞几乎消失,逐渐被胰腺导管上皮细胞和成纤维组织替代,即腺泡导管上皮化生(acinoductal metaplasia,ADM),细胞间隙充斥着大量的炎症细胞;胰腺组织内TUNEL凋亡信号增强;免疫组织化学染色法显示α-SMA和C-Caspase3的阳性染色显著高于24小时和对照组。使用胰蛋白酶抑制剂后,胰腺/体重比升高,HE染色显示细胞凋亡、ADM、纤维化的程度减轻,TUNEL凋亡信号减弱;免疫组织化学染色法显示α-SMA和C-Caspase3的阳性染色减少。结论:PRSS1~(R122H)突变基因能够使小鼠体内胰蛋白酶处于持续激活状态,阐明了急性胰腺炎发生过程中细胞凋亡事件的具体过程,当胰蛋白酶激活24小时后,腺泡细胞开始出现凋亡,但是较为局限,当胰蛋白酶持续激活72小时后,细胞出现大量凋亡事件,还伴随出现了ADM、星状细胞活化和慢性纤维化等表现。胰蛋白酶抑制剂的使用则改善了胰腺萎缩、细胞凋亡、ADM和慢性纤维化,揭示了PRSS1突变介导的胰蛋白酶活化、腺泡细胞凋亡与急性胰腺炎之间相互关系,为进一步探究急性胰腺炎的发生机制和临床治疗提供了更有力的依据。通过上述研究,本课题得出以下结论:1.PRSS1~(R122H)转基因小鼠在不同周龄时的外观、行为、发育特征、体重变化、胰腺组织病理学特征均与C57BL/6J小鼠无明显差异,且在50周龄以内无自发性胰腺炎。2.PRSS1~(R122H)突变有助于建立更加典型、稳定的雨蛙素诱导后的急性胰腺炎疾病模型,PRSS1~(R122H)突变增加了小鼠的胰腺腺泡细胞对雨蛙素的敏感性。3.PRSS1~(R122H)突变基因能够使小鼠体内胰蛋白酶处于持续激活状态,阐明了急性胰腺炎发生过程中细胞凋亡事件的具体过程,当胰蛋白酶激活24小时后,腺泡细胞开始出现凋亡,但是较为局限,当胰蛋白酶持续激活72小时后,细胞出现大量凋亡事件,还伴随出现了ADM、星状细胞活化和慢性纤维化等表现。胰蛋白酶抑制剂的使用则改善了胰腺萎缩、细胞凋亡、ADM和慢性纤维化,揭示了PRSS1突变介导的胰蛋白酶活化、腺泡细胞凋亡与急性胰腺炎之间相互关系,为进一步探究急性胰腺炎的发生机制和临床治疗提供了更有力的依据。


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