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《中国人民解放军海军军医大学》 2019年
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小鼠TGFβ-Smad2/3信号通路在心肌梗死后心脏重构中的作用及机制研究

黄帅波  
【摘要】:研究背景:急性心肌梗死(AMI)是全球范围内最主要的死亡原因之一。心梗后心脏修复和重构与肌成纤维细胞转分化密切相关。在受损心肌修复过程中,转化生长因子β(TGF-βs)是调节肌成纤维细胞反应最重要的细胞因子之一,由TGF-βs介导的细胞内信号通路主要分为Smad依赖性和非Smad依赖性信号通路。在Smad依赖性信号通路中,转化生长因子β受体(TGF-βR)通过磷酸化方式激活Smad2和Smad3,进而调控细胞核内相关基因表达。我们最近有研究表明,肌成纤维细胞特异性TGF-β/Smad3信号通路对心肌梗死后心肌组织修复有保护作用;相反,心肌细胞特异性TGF-β/Smad3信号通路促进心脏不良重构。作为与Smad3高度同源的Smad2蛋白,成纤维细胞和心肌细胞特异性TGF-β/Smad2信号通路在心脏基线结构和功能,以及心肌梗死后心脏重构修复过程中的作用尚不清楚。研究目的:分别比较心脏成纤维细胞、心肌细胞特异性TGF-β/Smad2和TGF-β/Smad3信号通路对机体稳态、基线心脏结构、基线心功能以及心肌梗死后心脏重构过程中发挥的作用,并且探讨TGF-β介导的Smad2和Smad3信号蛋白在肌成纤维细胞转化过程中发挥不同作用的细胞生物学和分子生物学机制。研究方法:本研究结合在体动物实验和体外细胞实验,分别比较细胞特异性Smad2和Smad3信号蛋白对维持正常心脏稳态、心肌缺血损伤后心脏修复重构作用的不同影响及可能机制。在体动物实验部分,通过Cre-loxP系统构建成纤维细胞特异性(Col1α2-Cre)、心肌细胞特异性(αMHC-Cre)、激活的肌成纤维细胞特异性(Periostin-Cre)Smad2和Smad3基因敲除小鼠,首先观察成纤维细胞特异性和心肌细胞特异性Smad2/3信号蛋白对心脏基线结构和功能、小鼠机体稳态的影响;随后通过非再灌注急性心肌梗死模型(AMI),观察比较肌成纤维细胞特异性Smad2和Smad3基因敲除(FS2KO和FS3KO)对心梗后心脏修复和纤维化重构的影响差异,以及Smad2/3对肌成纤维细胞功能、梗死瘢痕区成纤维细胞形态、排列结构等表型的影响差异。体外细胞实验部分,利用广泛Smad3基因敲除(Global S3KO)小鼠来源的心脏成纤维细胞,或通过小干扰RNA(siRNA)敲除成纤维细胞Smad2/3,从分子生物学角度观察并比较Smad2和Smad3对介导成纤维细胞激活的整合素(integrins)基因、成纤维细胞基质合成(ECMs)基因、平面细胞极化通路基因(PCPs)表达的影响,从而解释TGF-β介导的Smad2和Smad3信号通路对损伤后心肌重构产生不同影响的可能机制。研究结果:与野生型(WT)心脏成纤维细胞不同,S3KO小鼠来源的心脏成纤维细胞基质金属蛋白酶MMP-8表达不受转化生长因子(TGF-β1)的抑制;而且成纤维细胞特异性Smad3敲除可以显著增加TGF-β1刺激下MMP-8的分泌及其活性。蛋白质免疫印记(Western Blot,WB)结果提示,正常心脏组织有Smad2基线磷酸化激活,而Smad3无基线磷酸化激活。通过小干扰RNA(siRNA)分别沉默体外心脏成纤维细胞的Smad2和Smad3基因,发现对高张环境下成纤维细胞黏附分子(Adhesion Molecule)和细胞外基质(ECMs)合成基因的表达产生不同的影响;在体动物研究发现,他莫昔芬诱导的成纤维细胞特异性Smad2和Smad3基因敲除小鼠,对小鼠机体稳态、心脏基线结构和功能等方面均无显著影响。与心肌细胞特异性Smad3基因敲除(CMS3KO)小鼠不同,心肌细胞Smad2敲除(CMS2KO)雄性小鼠在6个月后心脏收缩功能较对照组Smad2 fl/fl显著下降,左心室出现明显的扩张性肥厚,但是随访到12月龄未见恶化;雌性CMS2KO小鼠心脏功能障碍的出现延迟到9月龄;蛋白质免疫印迹结果显示,雄性CMS2KO小鼠心肌组织中Smad2表达下调达90%,而雌性CMS2KO小鼠只有50%。在小鼠非再灌注心肌梗死模型中,双重免疫荧光染色结果显示,肌成纤维细胞Smad2和Smad3信号通路激活均在冠状动脉结扎后7天达高峰。体外细胞实验提示外源性TGF-β(10ng/ml,30min)通过磷酸化方式直接激活成纤维细胞Smad2/3信号通路,但是,骨形态蛋白(BMPs)和血管紧张素II(AngiotensinII)不能直接激活Smad2/3蛋白。在心梗晚期,肌成纤维细胞特异性Smad3基因敲除(FS3KO)小鼠表现出更高的死亡率和不良心脏重构,心室破裂发生率显著增加。与之相反,肌成纤维细胞特异性Smad2基因敲除(FS2KO)小鼠与对应的Smad2 fl/fl小鼠心梗后死亡率并无显著性差异。相反,FS2KO小鼠在心肌梗死后7天,左心室收缩功能、扩张性重构显著性优于Smad2 fl/fl组;而随访至心梗后28天,FS2KO和Smad2 fl/fl在心脏功能和重构方面无显著性差异。梗死心脏组织切片免疫荧光染色结果提示,尽管FS2KO和FS3KO小鼠心梗部位的肌成纤维细胞密度均显著性增加,却只有FS3KO小鼠梗死瘢痕结构紊乱,这与肌成纤维细胞在心肌梗死区、边缘区的形态异常、极化排列紊乱有关。整合素(integrin)参与成纤维细胞的激活,体外细胞实验结果显示,通过Smad3 siRNA干扰低张环境下的成纤维细胞Smad3基因(S3KD),可以显著下调collagen pad中成纤维细胞整合素α2和α5(integrinα2,α5)表达水平,但是Smad2 siRNA基因干扰(S2KD)对integrins表达无显著影响。在高张环境的培养皿中,成纤维细胞Smad3基因沉默(S3KD)可以显著下调参与细胞极化、细胞骨架重组调控的Rho GTP酶蛋白A(RhoA)的表达,相反,Smad2基因沉默(S2KD)却显著上调RhoA表达水平。此外,平面细胞极化(PCP)基因通路的核心家族还有多次跨膜蛋白卷曲家族成员Frizzled(Fz),通过分析发现,心脏成纤维细胞Smad2和Smad3体外基因沉默对Fz各个基因成员表达的影响各有差异。研究结论:心肌细胞特异性Smad2信号通路对维持正常心脏基线结构和功能发挥一定的作用,而心肌细胞Smad3信号通路主要参与心肌梗死后心脏重构。在正常心脏,成纤维细胞特异性Smad2/3对心脏稳态均无显著影响。在心肌梗死模型中,肌成纤维细胞特异性TGF-β/Smad3信号通路对心脏修复和重构有保护作用;而肌成纤维细胞Smad2基因敲除(FS2KO)可以暂时性显著改善心肌梗死后心脏收缩功能和心室扩张性重构。成纤维细胞特异性TGF-β/Smad3信号通路对心梗后组织修复的分子生物学机制与Smad3依赖的integrin介导的成纤维细胞的激活有关。同时,肌成纤维细胞的正常形态、结构排列、细胞外基质的合成对心肌梗死后心脏的修复和纤维化反应也发挥重要作用。RhoA作为平面细胞极化(PCP)信号通路的重要分子,其表达水平在S3KD成纤维细胞中显著下调,而在S2KD细胞中显著上调。综上所述,心肌细胞特异性Smad2参与心脏稳态调节;肌成纤维细胞特异性TGF-β/Smad2和TGF-β/Smad3信号通路在心肌梗死后心脏修复过程中的差异性效应与Smad2和Smad3信号分子对integrin和RhoA表达水平的差异性调节有关。
【学位授予单位】:中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R542.22

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