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《中国人民解放军海军军医大学》 2019年
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尿素循环关键酶CPS1在肝癌进展中的作用及机制研究

罗贵娟  
【摘要】:目的肝细胞癌是发病率逐年上升的最常见肝脏原发性恶性肿瘤。体内大部分代谢过程包括糖代谢、脂代谢以及氨基酸代谢等均在肝脏中发生。其中,尿素循环是氨基酸代谢产生的氨通过肝脏转化为尿素的重要代谢过程。近几年多篇研究报道了尿素循环在肿瘤中的关键作用,然而其是否参与肝癌发生发展尚未有系统报道,特别是尿素循环关键酶CPS1在肝癌中的生物学功能也不明确。因此本课题聚焦尿素循环及其关键酶CPS1在肝癌发生发展中的作用,以期为肝癌的精准治疗提供新靶点及证据支持。研究方法1、多数据库分析肿瘤中代谢情况利用TCGA数据库转录组数据,综合分析16种肿瘤类型(肝细胞肝癌、肺鳞状细胞癌、子宫内膜癌、肾乳头状细胞癌、肺腺癌、直肠腺癌、肾透明细胞癌、结肠腺癌、甲状腺癌、肾嫌色细胞癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润癌、胃腺癌、前列腺腺癌、头颈部鳞状细胞癌以及食管癌)、共7764例样本中代谢相关基因的异常情况;结合HCCDB数据库分析肝癌中尿素循环相关基因的表达情况,为课题研究提供可靠的现实依据;2、尿素循环关键酶CPS1在肝癌组织中的表达情况与临床病理特征和预后的相关性通过免疫组织化学方法分析我院17444例肝癌术后患者肝癌组织中CPS1的表达情况;同时根据免疫组化评分及临床病理资料、预后资料,分析肝癌CPS1的表达与临床病理特征的相关性及其对患者预后的影响;3、尿素循环关键酶CPS1对肝癌恶性表型的影响通过RT-PCR、Western-blot等分子生物学技术检测常见肝癌细胞及正常肝细胞中CPS1的表达水平;应用慢病毒感染构建稳定干扰或过表达CPS1的细胞,检测CPS1对肝癌细胞增殖、转移以及干性等恶性表型的影响;4、尿素循环关键酶CPS1影响肝癌恶性表型的机制利用RNA-Seq技术检测稳定干扰或过表达CPS1的细胞及其对照细胞中基因表达差异,寻找靶基因;并进一步深入研究CPS1如何通过调控靶基因影响肝癌恶性表型;5、CPS1对肝癌代谢的影响通过质谱、试剂盒定量检测等方式比较CPS1异常表达细胞与对照细胞中谷氨酰胺代谢、尿素循环及糖代谢情况;通过Seahorse XF96代谢检测仪检测CPS1异常表达细胞与对照细胞的代谢方式,明确其能量的提供来源;进一步通过靶向抑制该能量来源检测其对细胞增殖的影响;6、探索CPS1在肝癌中异常表达的原因查阅文献综合已报导的参与调控CPS1表达的因素,进行验证并进一步分析肝癌中CPS1异常表达的原因。结果1、肝癌中组织特异型代谢基因的异常最为显著。经过KEGG基因富集分析后,发现肝癌中尿素循环通路明显障碍;且在肝癌组织中尿素循环各催化酶的表达水平低于癌旁,其中关键酶CPS1的表达在癌旁肝组织、肝癌组织及门静脉癌栓中逐渐下降;2、在88.9%(15505/17444)的肝癌患者肝癌组织中CPS1均为低表达,且CPS1低表达与肝癌患者较短的术后总生存时间和复发时间相关,可以作为独立预测因素评估预后;3、CPS1低表达显著促进了肝癌细胞的转移、侵袭、干性等恶性生物学行为,尤其在促进肿瘤起始细胞扩增中有着重要作用;4、CPS1低表达的肝癌通过依赖αKG的表观遗传修饰上调FOXM1,进而促进Ep CAM阳性肝癌起始细胞扩增;5、CPS1低表达的肝癌主要依赖脂肪酸有氧氧化供能,而不是葡萄糖与谷氨酰胺;且其对脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir敏感;6、肝癌CPS1低表达的原因不仅包括之前报道的SIRT5、p-AMPK的调控,启动子区域高甲基化也参与调控CPS1低表达;通过甲基转移酶抑制剂处理后可以使CPS1低表达的肝癌细胞中CPS1表达明显升高。结论本研究从公共数据库大数据分析结果入手,结合大规模临床肝癌样本中CPS1表达与临床病理特征及预后相关性,明确了了CPS1低表达在肝癌中较为普遍(约占88.9%),与患者较短的生存期相关,且可以作为独立预测因素评估预后;之后通过分子生物学方法进一步探究发现CPS1低表达肝癌细胞通过CPS1-αKG-FOXM1轴促进Ep CAM阳性肝癌起始细胞扩增;且CPS1低表达导致肝癌细胞代谢程序重编,主要依赖脂肪酸氧化供能而对脂肪酸氧化抑制剂更敏感,为肝癌的临床研究提供新思路与新靶点。
【学位授予单位】:中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R735.7

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