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《中国人民解放军海军军医大学》 2019年
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APOBEC突变标签在结直肠癌发生发展中的作用及分子机制研究

杨帆  
【摘要】:研究背景:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的消化系统恶性肿瘤,其发病率和死亡率在我国近年来均呈上升趋势。载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽(apolipoprotein B mRNA editing catalytic polypeptide,APOBEC)家族是一类可以特异催化基因组中的胞嘧啶转化为尿嘧啶的基因编辑酶,生理条件下是人体固有免疫反应与抗病毒反应的关键参与者。然而在慢性炎症条件下,APOBEC家族会发生异常过表达,误伤人类基因组引发APOBEC特征性突变,即APOBEC突变标签。目前对于APOBEC突变标签的研主要着眼于APOBEC3B,其突变标签为TCW(下划线的为突变碱基,两侧为相邻碱基,W代表A/T)。既往研究显示,膀胱癌、头颈部鳞癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌中均存在APOBEC突变标签显著富集的情况,但是CRC中APOBEC突变标签的富集情况尚不清楚。近年来APOBEC其他家族成员的突变标签序列逐渐明确,且APOBEC与CRC相关关系的基础研究与流行病学研究层出不穷,因此亟需在开展综合、系统的流行病学研究以探讨APOBEC在CRC发生发展中的作用。研究目的:从APOBEC致突变的机制出发,明确APOBEC各个家族成员的特征性突变标签在CRC患者中的富集情况;进而从环状RNA的差异表达与APOBEC关系、APOBEC表达量在各疾病阶段之间的表达量变化趋势、APOBEC的差异表达与CRC患者预后的关系、APOBEC先天遗传易感性四个方面,全面综合探讨APOBEC与CRC发生发展的关系。研究方法:对16名CRC患者的组织样本进行全外显子捕获测序获得患者肿瘤组织和癌旁腺瘤性息肉的体细胞突变信息,通过查阅最新文献确定各个APOBEC家族成员的特征性突变标签。通过单侧Fisher精确检验,明确各APOBEC家族成员的突变标签在样本中的富集情况。通过比较显著富集各APOBEC家族成员突变标签的样本构成比,明确发挥作用最显著的APOBEC家族成员。随后采用TCGA(The Cancer Genome Atlas)公共数据库的数据对以上结果进行验证。另利用19名患者组织样本的全转录组测序数据,通过CIRI和find_circ两款软件进行环状RNA(circular RNA,circRNA)预测,利用R软件的edgeR软件包筛选癌与癌旁组织差异表达的circRNA,后利用基因项富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)对差异表达circRNA功能进行预测。在来自长海医院的846名研究对象中采取病例对照列研究方法,以56例痔疮患者为对照组,以51例腺瘤性息肉患者和739例CRC患者为病例组。通过对其病灶组织的免疫组织化学染色评分,评估病例组与对照组之间活化诱导的胞苷脱氨酶(activation induced cytidine deaminase,AID)、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3G、嘧啶DNA糖基化酶(uracil DNA glycosylase,UNG)的表达水平,采用Kruskal-Wallis检验比较CRC发展各阶段上述分子表达量的差异,找出腺瘤性息肉或CRC发生的潜在生物学标志物。在上述739例CRC患者中,采用队列研究方法,以肿瘤组织中AID、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3G、UNG的表达量高低为暴露因素。对研究对象进行随访以了解其生存和肿瘤复发状况。采用Kaplan-Meier方法分析暴露因素对患者总体生存和无瘤生存的影响,采用多因素Cox回归模型筛选CRC患者总体生存和无瘤生存的独立影响因素。在来自长海医院和杨浦区中心医院的2044例研究对象中采取病例对照研究方法,以1240例健康体检人群为对照组,以164例结直肠腺瘤性息肉患者和640例CRC患者为病例组。提取研究对象外周血基因组DNA,采用Taqman探针法测定APOBEC3A、APOBEC3B以及UNG共3个基因的4个SNP位点rs12157810、rs2267401、rs12628403、rs3890995基因型,采用logistic回归分析比较各SNP位点在对照组与病例组之间的等位基因频率分布,以明确所研究SNP位点在CRC发生中的作用。研究结果:1、在自测CRC组织样本中,AID和APOBEC3D的突变标签(WRC和WWC)占所在样本总单碱基突变(single nucleotide variant,SNV)的比例均显著高于其他APOBEC家族成员,该结果在TCGA数据库的489例CRC组织的外显子捕获测序数据中得到了很好的验证,结果完全一致。在自测癌旁腺瘤性息肉组织中进行的相同分析也得到了类似的结果。APOBEC突变标签富集分析发现,显著富集AID和APOBEC3D的自测癌组织样本最多,分别占25%和18.8%;而在TCGA数据库的外显子测序数据中,显著富集AID和APOBEC3A突变标签的癌组织样本最多,分别占13.1%和5.3%,显著富集APOBEC3D突变标签的癌组织样本则相对较少,仅有1.6%。2、经CIRI和find_circ软件预测,全转录组测序数据共发现7701条circRNA,25条为CRC患者癌组织与癌旁组织之间表达量存在显著差异的circRNA,其中如下5条在GSEA中可以富集到较多的基因项:X:131749306|131794466,9:16435555|16437524,6:160397979|160410846,14:96833467|96860735,12:55700899|55701154。其中X:131749306|131794466,6:160397979|160410846以及14:96833467|96860735的表达与C2基因集中大多数基因项的表达呈正相关关系,而9:16435555|16437524和12:55700899|55701154与C2基因集中大多数基因项的表达呈负相关关系。其中6:160397979|160410846显著富集(FDR=0.081)的基因项CHANG CORE SERUM RESPONSE UP与基因项REACTOME VIF MEDIATED DEGRADATION OF APOBEC3G在基因的组成上非常类似(交互信息评分=7.59)。3、AID、APOBEC3G在CRC患者病灶中的免疫组织化学染色评分(histochemistry score,H-score)均显著高于腺瘤性息肉患者和健康对照人群(P均0.001),而这两个个基因在腺瘤性息肉患者和健康对照人群的病灶组织的H-score则没有显著统计学差异(P分别为0.349和0.440);APOBEC3B在CRC患者和腺瘤性息肉患者病灶中的H-score显著高于对照组(P均0.001),而APOBEC3B在CRC患者和腺瘤性息肉患者病灶中的H-score则没有显著统计学差异(P=0.421)。相比之下,APOBEC3A和UNG的H-score在各组之间没有显著统计学差异(两两比较P均0.05)。4、AID的高表达和UNG的低表达会显著提高CRC患者的术后复发率(P分别为0.017和0.044)。APOBEC3B或APOBEC3G的高表达会显著提高CRC患者的总体生存率(APOBEC3B P=0.020,APOBEC3G P=0.009),降低术后复发率(APOBEC3B P=0.002,APOBEC3G P=0.002)。按肿瘤位置进行分层分析,APOBEC3B和APOBEC3G高表达会显著提高结肠癌患者的总体生存率(P均0.001),降低术后复发率(APOBEC3B P=0.0314,APOBEC3G P0.001);APOBEC3A和APOBEC3B的高表达会显著降低直肠癌患者的术后复发率(P分别为0.024和0.039)。多因素Cox回归分析显示,排除年龄、性别、术后化疗与否、TNM分期、肿瘤分化程度、术前血清癌胚抗原、术前血清糖链抗原19-9的影响后,APOBEC3G的高表达是结肠癌患者总体生存的独立保护因素(HR=0.36,95%CI=0.20-0.63)。5、在APOBEC3B发生缺失突变的患者中,APOBEC3A启动子区SNP位点rs12157810位点的CC基因型是健康人群发生CRC的危险因素(adjusted odds ratio,AOR=10.03,95%CI=3.11-32.32)。将所有研究对象按照性别进一步分层后,APOBEC3B发生缺失突变的女性患者中,rs12157810位点的基因型在健康人群、腺瘤性息肉患者和CRC患者中的分布没有显著差异,而在APOBEC3B发生缺失突变的男性患者中,rs12157810位点CC的基因型是健康人群发生CRC的危险因素(AOR=3.49,95%CI=3.49-218)。研究结论:1、AID是CRC发生过程中起到主要致突变作用的APOBEC家族成员,其致突变作用是CRC发生早期的分子事件。2、发现了5条在CRC的癌与癌旁显著差异表达,功能预测分析显示在CRC的发生过程中可能起到关键作用的环状RNA:X:131749306|131794466,9:16435555|16437524,6:160397979|160410846,14:96833467|96860735,12:55700899|55701154。其中6:160397979|160410846可能与APOBEC3G的降解有关。3、AID、APOBEC3B、APOBEC3G是潜在的CRC生物学标志物,其中APOBEC3B是潜在的腺瘤性息肉生物学标志物。4、AID高表达和UNG低表达会显著提高CRC患者的术后复发率。APOBEC3B、APOBEC3G高表达是结肠癌患者预后良好的标志物,其中APOBEC3G高表达是结肠癌患者总体生存的独立保护因素。5、在APOBEC3B发生缺失突变的人群中,APOBEC3A启动子区的SNP位点rs12157810的CC基因型是CRC发生的危险因素。而且这种致癌作用有性别差异,在男性群体中更为显著。
【学位授予单位】:中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R735.3

【参考文献】
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【二级参考文献】
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