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《中国人民解放军海军军医大学》 2019年
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SIRT1基因沉默对肝癌干细胞的影响及作用机制研究

陈佳佳  
【摘要】:研究背景:肝癌(Liver cancer)是常见的消化系统恶性肿瘤之一,在全球范围内,其发病率居第六位,死亡率居第四位。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌,其恶性程度高,细胞异质性大。肝细胞癌的传统治疗方式主要包括手术切除治疗、化疗以及放疗,但复发率高,难以从根本上治愈。肝癌干细胞(Liver stem cells,CSCs)的存在可能使传统的肿瘤治疗方式面临巨大的挑战,它们是一群具有自我更新、多向分化潜能、具有启动和重建肿瘤组织表型能力的肿瘤细胞。肝癌高转移高复发的根源可能是肝癌干细胞启动了其耐药机制而对放疗及化疗药物不敏感。因此,寻找新的、有效地靶向肝癌干细胞的治疗方法,对于肝癌的长期稳定缓解乃至治愈起着至关重要的作用。癌症的衰老疗法是一种新型的肿瘤治疗策略,细胞衰老(Cellular senescence)被认为是有效的肿瘤抑制机制。正常细胞走向衰老后会被机体免疫系统清除,而细胞发生衰老逃逸后会不受细胞周期的调控而进行无限制的增殖从而发生肿瘤。因此,若能够使得肿瘤细胞重新回到衰老状态而促发机体自身免疫清除系统,那将极大地缓解目前肝癌治疗的瓶颈问题。研究报道SIRT1在多种肿瘤干细胞中高表达并与患者的不良预后密切相关。但同时近年来的研究显示SIRT1在成体干细胞如造血干细胞、间充质干细胞等的衰老及衰老逆转中起重要作用。因此我们推测通过调控SIRT1的表达水平诱导肝脏肿瘤干细胞发生衰老可能是一种有效抑制肝癌发生发展的手段。研究方法:(1)通过原位免疫组化染色分析及western blot在肝癌组织标本以及肝癌干细胞和非干细胞中检测SIRT1的表达水平;(2)通过构建shRNA调控SIRT1的表达分析肝癌干细胞中干性基因的表达变化,以及EdU实验检测干细胞增殖水平的变化;(3)通过体外克隆形成实验和成球实验以及体内裸鼠成瘤实验分别检测干扰SIRT1后,肝癌干细胞的自我更新和成瘤能力的变化;并对所形成的肿瘤进行SIRT1和EpCAM免疫组织化学原位染色;(4)通过细胞衰老相关指标如衰老相关β半乳糖苷酶活性、细胞周期抑制因子P53、P21、P16及p53-p21和p16信号通路相关蛋白CDK2和CDK4的检测来评价干扰SIRT1抑制肝癌干细胞增殖的衰老机制,并通过原位免疫组织化学染色检测体内成瘤组织中P21和Ki67的表达变化。研究结果:(1)SIRT1在肝癌组织中的表达远高于癌旁组织;并且在肝癌组织中CD13阳性和EpCAM阳性的肝癌干细胞中SIRT1的表达明显高于CD13或EpCAM阴性的细胞;SIRT1在肝癌细胞系特别是Nanog~(Pos)的肝癌干细胞中处于高表达水平;(2)下调肝癌干细胞中SIRT1的表达后,肝癌干细胞中干性相关标志物如Nanog、SOX2、OCT4、CD13、CD44和EpCAM的表达水平显著降低,同时肝癌干细胞的增殖水平随着SIRT1表达的抑制而降低;(3)干扰SIRT1抑制了Nanog~(Pos)肝癌干细胞的克隆形成能力、成球能力以及成瘤能力;并且SIRT1高表达的对照组肿瘤中EpCAM阳性的干细胞比例明显高于SIRT1低表达组。(4)抑制SIRT1的表达后,肝癌干细胞中衰老相关β半乳糖苷酶活性增高,细胞周期抑制因子P53、P21、P16的表达增加。同时,p53-p21和p16信号通路相关蛋白CDK2和CDK4的表达下降,进一步证明抑制SIRT1表达可能是通过激活p53-p21和p16信号通路而促进肝癌干细胞发生衰老的。并且SIRT1高表达的对照组肿瘤中Ki67高表达而P21阳性的细胞比例非常低,相反,SIRT1表达抑制组的肝癌干细胞成瘤组织中P21的表达明显升高而Ki67阳性的细胞显著减少,进一步说明了下调SIRT1表达后肝癌干细胞发生衰老从而抑制了其自我更新能力并抑制肝癌的发展。结论:SIRT1在肝癌干细胞中高表达,而抑制SIRT1的表达可以降低肿瘤干细胞的干性特征、自我更新和成瘤能力。下调SIRT1的表达通过调控p53-p21和p16信号通路而促进肿瘤干细胞发生衰老从而抑制肝癌的发展。该研究将是肝细胞癌治疗的一个新的突破,通过肝癌干细胞衰老抑制肝癌,为临床肝癌的治疗提供了新的思路。
【学位授予单位】:中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R735.7

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