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长期有氧运动通过外泌体介导的miR-342-5p发挥心脏保护作用及其机制

侯作旭  
【摘要】:研究背景:缺血性心脏病是当今威胁人类健康的“头号杀手”,虽然经皮冠状动脉介入等治疗措施能够迅速疏通堵塞的血管,但是会引起严重的心肌二次损伤,即心肌缺血/再灌注(MI/R)损伤。因此,研究有效的内源性心肌保护策略意义重大。流行病学调查和实验研究均表明,有氧运动不仅能降低心血管疾病的危险因素,而且具有直接的心脏保护作用,但其作用机制尚不清楚。近年发现,运动可致机体多种组织分泌运动因子(exerkine,如白细胞介素-6、鸢尾素等),后者以旁分泌或内分泌方式介导运动的全身效应。目前,寻找新的运动因子并挖掘其潜在的应用价值已成为国际运动与健康科学研究的一个重要方向。外泌体(exosome)是细胞分泌的纳米级(30-100 nm)囊泡,能够通过其携带的mi RNAs,多肽和蛋白质等生物活性物质向临近或远距组织器官传递信息,影响细胞功能。因此,外泌体介导了一种新的细胞间通讯方式。循环中外泌体的浓度高达1010数量级,并且其与机体状态密切相关。新近研究发现,健康受试者单次急性运动后即刻,循环外泌体的数量增加,并且循环外泌体中超过300种蛋白质的量也明显增加,提示循环外泌体可能在运动的系统性适应中发挥重要作用。但是,目前长期有氧运动对循环外泌体的影响及其在运动促进心脏健康中的作用尚不清楚。实验目的:1.明确长期有氧运动条件下循环外泌体的变化。2.揭示循环外泌体在运动心脏保护中的作用及其主要机制。实验方法:1.招募空军军医大学赛艇队运动员和不运动对照学员研究长期有氧运动对人循环外泌体数量及成分的影响。2.构建SD大鼠4周游泳运动模型研究长期有氧运动对大鼠循环外泌体数量、成分及功能的影响。3.在末次运动结束后24 h时采用超速离心法分离血浆外泌体,用透射电镜和蛋白免疫印迹技术鉴定外泌体,采用纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术分析提取的外泌体粒径分布情况。4.构建SD大鼠MI/R(30 min/24 h)模型和原代培养的乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(H/R,12 h/3 h)模型,评估长期有氧运动诱导的循环外泌体的心肌保护作用。5.采用mi RNA高通量测序技术分析运动组和安静对照组大鼠循环外泌体中mi RNAs的表达差异。采用实时定量PCR(q RT-PCR)技术检测外泌体和组织中特定mi RNA的水平。6.采用双荧光素酶报告基因系统和蛋白免疫印迹技术确定特定mi RNA靶基因。7.采用修饰的腺相关病毒(AAV9)和mi RNA agomir在体下调或者上调心脏特定mi RNA水平。8.采用Graph Pad Prism软件进行统计学分析。实验结果:1.与安静对照组大鼠相比,运动组大鼠MI/R后,心肌梗死面积减小,血清乳酸脱氢酶(LDH)活性明显降低,表明4周游泳运动能够保护心肌,减轻MI/R损伤。2.赛艇运动员和不运动对照学员相比,循环外泌体的数量在末次运动结束24 h后无统计学差异;运动组大鼠和安静对照组大鼠相比,循环外泌体的数量在末次运动结束24 h后也无明显变化。但是,运动组大鼠血浆外泌体(Exe-exo)具有明显的心肌保护作用,其预孵育心肌细胞48 h能够减轻心肌细胞H/R损伤,表现为心肌细胞凋亡和LDH释放减少,心肌细胞活力提高。安静对照组大鼠循环外泌体(Sed-exo)预孵育心肌细胞48 h未见显著减轻心肌细胞H/R损伤。3.接受Exe-exo心肌点注射大鼠,MI/R后心肌梗死面积较PBS注射组明显减小(35.6±4.3%vs.58.6±3.5%,p0.01;n=11),血清LDH水平也明显降低,并且心脏功能(左室内压最大上升/下降速率和左室舒张末压)明显改善。与PBS注射组相比,Sed-exo无明显的心肌保护作用。4.采用Illumina Hi Seq 2500高通量测序平台对Exe-exo和Sed-exo包含的mi RNAs进行分析,发现14个差异表达的mi RNAs(筛选条件为量相差2倍以上并且p0.05)。进一步采用q RT-PCR对这14个差异表达的mi RNAs进行验证,最终确定了12个差异表达的mi RNAs。5.采用体外培养的乳鼠心肌细胞H/R模型对上述差异表达的mi RNAs进行功能筛选,发现mi R-342-5p具有显著的心肌保护作用,能够减轻H/R引起的心肌细胞凋亡和LDH释放,同时增加细胞活力。6.与不运动对照学员相比,赛艇运动员血浆外泌体mi R-342-5p的水平增加了80%。7.生物信息学分析,蛋白免疫印迹和双荧光素酶报告基因分析结果表明,促凋亡基因Caspase9和Jnk2是mi R-342-5p的靶基因,并且用mi R-342-5p mimic预孵育心肌细胞能够抑制H/R引起的Caspase3,Caspase9激活并降低磷酸化Jnk2(Thr183/Tyr185)水平,提示mi R-342-5p能够通过靶向抑制促凋亡基因Caspase9和Jnk2发挥心肌保护作用。8.mi R-342-5p mimic和inhibitor可分别增加和降低体外培养的心肌细胞磷酸化Akt(Ser473)水平,但对Erk1/2的磷酸化(Thr202/Tyr204)无明显影响。生物信息学分析,蛋白免疫印迹和双荧光素酶报告基因分析结果表明,磷酸酶Ppm1f是mi R-342-5p的靶基因。用小干扰RNA下调心肌细胞Ppm1f蛋白水平可增加Akt(Ser473)磷酸化水平,并且抑制H/R导致的心肌细胞凋亡。9.长期有氧运动增加心脏,骨骼肌,主动脉,肝脏,脂肪组织,肾脏以及脾脏mi R-342-5p的前体和成熟体水平,其中主动脉增加最多。循环外泌体中不含mi R-342-5p的前体,提示长期有氧运动增加的循环外泌体mi R-342-5p来源于多个组织。10.长期有氧运动增加心脏mi R-342-5p水平,降低Caspase9,Jnk2和Ppm1f的蛋白表达量并增加Akt(Ser473)磷酸化水平。4周游泳训练开始前1周给予大鼠心肌点注射携带抗mi R-342-5p序列的AAV9,能够显著降低运动大鼠心脏mi R-342-5p水平,并且减弱长期有氧运动的心脏保护作用,表现为MI/R条件下心肌梗死面积增大和心肌细胞凋亡增加。预先心肌点注射mi R-342-5p agomir增加心脏mi R-342-5p水平可减小大鼠MI/R心肌梗死面积。结论:1.长期有氧运动结束24 h后,循环外泌体的数量虽无明显改变,但是其发生了“质变”,具有心脏保护作用,能够减轻心肌缺血/再灌注损伤。2.mi R-342-5p是长期有氧运动诱导的循环外泌体中发挥心脏保护作用的关键成分,其通过靶向抑制促凋亡分子(Caspase9和Jnk2)和激活生存信号(Akt)发挥心肌保护作用。本研究揭示了长期有氧运动通过循环外泌体发挥心脏保护作用的一个新机制,提示外泌体mi R-342-5p是一种新的心脏保护性运动因子,为运动裨益心脏健康和开发心脏保护性药物提供了新的实验依据。


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