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羽衣甘蓝SRK和SCR的克隆表达及克服自交不亲和性的研究

于晓敏  
【摘要】: 羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)是一种典型的孢子体型自交不亲和性(Self-incompatibility,SI)植物,在遗传上,羽衣甘蓝SI受具有复等位基因的S单倍型控制,并且认为S单倍型上S受体蛋白激酶(S-locus receptor kinase,SRK)和S位点富含半胱氨酸的蛋白(S-locus cysteine-rich protein,SCR)/SP11(S-locus protein 11)分别控制着花粉(雄性)和柱头乳突细胞(雌性)的SI。本文获得了SRK激酶域的cDNA片段、SRK表达的全长序列、SCR cDNA序列和SCR DNA序列克隆共四个克隆。确定了本试验材料9号“赤兔”自交不亲和系的基因型为S_(13b)单倍型。并进行了一些克服花粉自交不亲和性的探索性试验。得到以下结论: (1)采用Northem杂交方法确定了SRK基因只在>10mm和8-10mm长的花蕾中有表达,且>10mm花蕾的表达量大于8-10mm花蕾的表达量。 (2)分离出一种新基因SCR_(13b),此基因与SCR_(13)序列有较高的同源性,它含有一个758 bp的内含子,编码一个由78个氨基酸组成的蛋白质。SCR_(13b)在N端含有24个氨基酸的信号肽区域,在C端有由54个氨基酸组成的成熟蛋白区域。在原核细胞中表达并纯化了SCR_(13b)蛋白,获得了一个约32kDa左右的蛋白质条带,为进一步探讨SCR_(13b)的功能奠定了基础。 (3)确定了克服花粉自交不亲和性的CO_2激光和高压静电场的处理剂量,即CO_2激光的T_1S_1(烧灼延时5’,照射一次)处理,高压静电场的E3(75kV/m)处理。 (4)通过测量花粉管萌发率及一定时间内花粉管的萌发长度,我们知道在花粉萌发培养基中加入自交不亲和系同株柱头的蛋白粗提物会抑制花粉管的萌发和生长。萌发前加入不亲和柱头蛋白,电场处理的萌发率高于未处理花粉的萌发率:萌发后加入不亲和柱头蛋白,电场处理过的花粉管能继续生长,而未处理的花粉管则停止生长。 (5)用fluo-3标记花粉管中的Ca~(2+),激光共聚焦显微镜观察后发现电场处理过的花粉受到不亲和刺激后仍然保持着Ca~(2+)浓度梯度,花粉管可继续生长;而没有被电场处理过的花粉受到不亲和刺激后其Ca~(2+)浓度梯度消失,Ca~(2+)在花粉管内呈弥散状态。 (6)通过蛋白质双向电泳实验,我们比较了电场处理花粉自交授粉3h(电场)后柱头蛋白的表达、未处理花粉自交授粉3h(自交)后柱头蛋白表达、杂交授粉3h(杂交)后柱头蛋白表达、未授粉空柱头(CK)的蛋白表达四者之间的差异,结果显示电场处理后的蛋白表达与杂交的蛋白表达相似,都在同一区域比CK和自交图谱多了一些表达点,况明这些点是授粉后亲和情况下表达的蛋白点,而电场处理使本应不亲和的过程变得亲和,电场对克服植株的自交不亲和性起到了一定作用。


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