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《中南大学》 2008年
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农达(41%草甘膦)对人L-02肝细胞损伤的研究

王非  
【摘要】: 目的: 探讨农达(41%草甘膦)对人L-02肝细胞产生的损伤作用及其可能的机制。 方法: 体外试验(in vitro test)以L-02肝细胞为受试细胞,通过MTT法检测不同浓度的农达对L-02肝细胞存活率的影响,选择细胞存活率为20%-80%的浓度进行后续实验。设置5个农达处理组,60mg/L、90mg/L、120mg/L、150mg/L、180mg/L和1个阴性对照组(PBS),农达处理细胞时间为24h。L-02肝细胞的形态学改变采用姬母萨染色法在光镜下观察结合透射电镜观察;农达对L-02肝细胞膜通透性影响和细胞毒性作用采用谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性水平结合台盼蓝拒染法来评价;农达诱导L-02肝细胞氧化损伤程度选用超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)含量等指标评价;用线粒体跨膜电位(△Ψm)检测细胞线粒体损伤;用DNA条带(DNA-Ladder)检测肝细胞DNA损伤;以AnnexinV-FITC/PI复染法测定细胞发生凋亡和坏死的情况;Western Blotting检测对照组与90mg/L组细胞色素C(Cyt C)和凋亡诱导因子(AIF)表达水平。 结果: 1.在60~180mg/L的处理浓度范围内,能明显引起L-02肝细胞存活率的降低(P<0.05),处理浓度和细胞存活率之间存在负相关(r=-0.974)。 2.在光镜下观察姬母萨染色L-02肝细胞爬片,观察到各农达处理组L-02肝细胞皱缩或肿大,形态由瓦片状收缩为圆形,细胞间隙扩大,细胞破裂,染色质浓缩,贴壁细胞密度和数量减少。电镜下观察,可发现处理组细胞出现表面微绒毛消失,细胞膜结构不完整,细胞核碎裂或肿胀,线粒体空泡样变等细胞凋亡或坏死的表现。 3.农达处理L-02肝细胞,其活细胞台盼兰蓝染比例升高(P<0.05);细胞培养上清液中ALT活性增加(P<0.05);从90mg/L组开始AST活性增加(P<0.05);农达导致处理组细胞内MDA的含量增加,SOD活性减弱,GSH含量减少(P<0.05);农达导致120~180mg/L组细胞Na~+-K~+ ATP酶活性降低(P<0.05)。 4.农达处理能诱导细胞DNA链断裂,处理浓度在150mg/L、180mg/L,DNA受损程度严重;90mg/L组Cyt C和AIF表达水平高于对照组(P<0.05);90mg/L组开始用农达处理的L-02细胞线粒体膜电位明显降低(P<0.05);农达能明显诱导处理组肝L-02细胞发生凋亡和坏死(P<0.05),随着处理农度的增高,细胞凋亡和坏死的比例增高,但是在180mg/L组凋亡比例下降。 结论: 农达在60mg/L~180mg/L范围内,能引起L-02肝细胞存活率下降,细胞膜通透性增加,抑制细胞离子转运,诱发DNA损伤,线粒体膜电位降低,Cyt C、AIF等凋亡因子泄漏,使细胞产生凋亡和坏死,对肝细胞具有明显的损伤作用;其损伤的作用机制可能与农达导致肝细胞氧化损伤、线粒体崩溃等途径有关。
【关键词】:农达 肝细胞 氧化损伤 线粒体损伤 细胞凋亡
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R363
【目录】:
  • 摘要4-6
  • ABSTRACT6-10
  • 第一章 前言10-13
  • 第二章 材料与方法13-28
  • 2.1 材料13-16
  • 2.1.1 受试生物13
  • 2.1.2 主要试剂13-14
  • 2.1.3 试剂配制14-15
  • 2.1.4 主要仪器15-16
  • 2.2 方法16-28
  • 2.2.1 试验技术路线16
  • 2.2.2 L-02肝细胞培养16-17
  • 2.2.3 肝细胞生存率测定(MTT法)17
  • 2.2.4 细胞形态学观察(姬母萨染色)17-18
  • 2.2.5 细胞形态学观察(透射电镜)18
  • 2.2.6 细胞通透性和细胞毒性检测18-19
  • 2.2.7 细胞DNA的损伤的检测(DNA-Ladder法)19-20
  • 2.2.8 细胞氧化损伤指标的测定(化学比色法)20-23
  • 2.2.9 细胞凋亡率(Annexin V-FITC/PI复染法)23
  • 2.2.10 线粒体跨膜电位(△ψm)测定(荧光分光光度法)23-24
  • 2.2.11 Western Blotting法检测Cyt C和AIF24-26
  • 2.2.12 肝细胞ATP酶活性检测(化学比色法)26-27
  • 2.2.13 统计分析27-28
  • 第三章 结果28-39
  • 3.1 农达对L-02细胞存活率的影响28-29
  • 3.2 农达对L-02细胞形态学的影响29-33
  • 3.3 农达对细胞凋亡和死亡率的影响33-34
  • 3.4 农达对细胞抗氧化系统损伤的影响34-35
  • 3.5 农达对细胞膜通透性影响和细胞毒性作用35
  • 3.6 农达对线粒体膜电位的影响35-36
  • 3.7 农达诱导Cyt C、AIF表达水平升高36-37
  • 3.8 农达导致细胞DNA损伤37-38
  • 3.9 农达对ATP酶的影响38-39
  • 第四章 分析与讨论39-45
  • 4.1 农达引起L-02肝细胞凋亡和坏死39-40
  • 4.2 农达诱导肝细胞产生氧化损伤40-41
  • 4.3 农达导致细胞膜通透性增加41
  • 4.4 农达对线粒体的影响41-42
  • 4.5 农达对细胞核的损伤42-43
  • 4.6 氧化应激、DNA损伤、线粒体损伤的作用及相互关系43-45
  • 第五章 结论45-46
  • 参考文献46-50
  • 综述50-62
  • 参考文献56-62
  • 致谢62-63
  • 研究生期间的成绩63

【引证文献】
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