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紫杉醇前体合成途径两个关键酶基因克隆和分析

刘万宏  
【摘要】: 紫杉醇是从药用植物红豆杉中分离出的具有抗癌作用的天然产物,是最好的天然抗癌药物之一。由于红豆杉生长缓慢且紫杉醇含量非常低,所以完全不能满足患者的需求。开展红豆杉的基因工程为解决药源缺乏的问题提供了崭新的思路,因此开展紫杉醇生物合成途径的分子生物学研究是开展红豆杉基因工程的首要工作。 紫杉醇前体生物合成源于新近发现的MEP途径。为研究紫杉醇前体生物合成途径的分子生物学,本文采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法从曼地亚红豆杉(Taxus media)中首次克隆了MEP途径上两个关键酶基因的全长cDNA,包括曼地亚红豆杉2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶基因(2-C-Methyl-D-erythritol4-phosphate cytidyltransferase,MECT)和曼地亚红豆杉2-C-甲基赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶基因(TmMECPS),并对这些基因进行了详尽的分析和功能验证。 2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶是紫杉醇前体生物合成MEP途径上的第三个酶。本试验采用RACE方法,第一次从曼地亚红豆杉中获得了MECT基因(命名为TmMECT)。TmMECT全长1301 bp,包括5'和3'非翻译区、polyA尾巴和一个编码939 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),它编码一条312个氨基酸残基的MECT蛋白质,其分子量预测为34.33kDa,等电点为8.96;组织差异表达研究显示,TmMECT在红豆杉根、叶、树皮、茎中均有表达,在叶和树皮中表达量较高。颜色互补试验表明TmMECT可以加速β-胡萝卜素的积累。对TmMECT基因的克隆和功能分析将会有助于在分子水平上更好地了解MECT在紫杉醇生物合成中的作用。 2-C-甲基赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶(2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphatesynthase,MECPS)是紫杉醇前体生物合成MEP途径中第五步反应酶。利用RACE技术首次从曼地亚红豆杉中获得MECPS基因(命名为TmMECPS)。根据生物信息学分析TmMECPS基因cDNA全长为899 bp,含有一个726 bp的开放阅读框(ORF),编码一个由241个氨基酸残基组成的蛋白质;预测的分子量约为26.1 kDa,等电点(pI)为8.22。同源比对与生物信息学分析表明,TmMECPS蛋白与其它物种的MECPS蛋白具有较高的同源性,并且具有MECPS蛋白家族的保守区域。系统发生树分析表明,TmMECPS蛋白在进化上比其它绝大多数植物的MECPS蛋白更为古老。组织表达分析表明,TmMECPS基因在根、茎、皮、叶中均有表达,但表达水平存在差异,叶与皮中表达量较根与茎要高。功能验证试验表明,TmMECPS蛋白能够促进β-类胡萝卜素的产生与积累。TmMECPS基因的克隆与研究为进一步了解TmMECPS在紫杉醇合成途径中的作用打下了基础。


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