冠状病毒复制酶系结构与功能研究

【摘要】：冠状病毒(Coronaviridae / Coronavirus,CoV)是一类对人和家畜/禽造成严重危害的病原微生物,其中的SARS(Severe Acute Respiratory Syndromes)- CoV更是于2003年在全球大规模爆发,给全球经济造成了重大生命财产损失,也引起了人类对冠状病毒的广泛关注。 冠状病毒的复制机制较为复杂:侵染细胞后,通过直接翻译与转录-翻译得到包括非结构蛋白(non-structural protein,nsp)、结构蛋白(structural protein)与附属蛋白(accessory protein)在内的一系列病毒蛋白,其中非结构蛋白被认为是冠状病毒复制酶复合物的功能单元,对冠状病毒的转录/复制过程有重要作用。 冠状病毒的非结构蛋白经过病毒蛋白酶酶切,成为有活性的功能单元,它们在冠状病毒的转录与复制过程中发挥着不同的作用,其中nsp7与nsp8形成的桶状十六聚体复合物具有合成短链RNA的活性,被认为是冠状病毒引物酶。然而该酶的结构与传统核酸合成酶完全不同,很难从已知结构推测出它的具体酶活工作机制。为了阐明该引物酶的工作机制,我们通过共晶与浸泡的方法解析出了两个复合物结构:nsp8活性结构域与单链RNA类似物复合物结构、全长nsp7-nsp8与GDP的复合物结构,并基于这两个结构提出了引物酶工作模型:病毒RNA穿过桶状结构的中心通道,模板区域在通道边缘的一个缺口处弯折,合成子链的所需的NTP从相邻的一个带正电荷的缺口处进入并与模板相遇。这是新的RNA依赖型RNA聚合酶活性机制,也是冠状病毒引物酶首个基于实验结构数据的模型。 本研究中我们也解析了一种新发现的冠状病毒HCoV-HKU1的非结构蛋白nsp5(即主蛋白酶M~(pro))的结构,该结构是抗冠状病毒药物的重要靶点,也是第二族群A类冠状病毒的第一个M~(pro)结构。虽然各冠状病毒族群的M~(pro)的底物P1位氨基酸极为保守,但是我们在HCoV-HKU1的M~(pro)结构中发现,其S1口袋的特殊性使得HCoV-HKU1 M~(pro)仍能切割P1突变的底物。在与其它冠状病毒的M~(pro)结构比较中我们还观察到,尽管各族群M~(pro)的主链结构比较接近,它们在底物结合口袋的S2位置却有着鲜明的族群特异性。