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产气肠杆菌荧光定量追踪及其NADH产氢途径机理研究

张翀  
【摘要】: 氢酶催化的产氢代谢及其网络的优化和调控是生物制氢的重要研究方向。本论文以快速产氢菌Enterobacter aerogenes为研究对象,围绕生物制氢领域的两个前沿问题:1)厌氧混合产氢系统内菌群动态分布解析方法;2)“NADH途径”分子机制及其调控方法进行研究,建立发酵生物制氢的基础研究平台。 将绿色荧光蛋白(GFP)应用于厌氧培养体系中产氢菌的定量追踪。建立了好氧荧光恢复(AFR)的方法,解决了GFP在厌氧条件下不能形成荧光呈色基团的瓶颈问题,从而实现E. aerogenes厌氧发酵产氢过程的全程追踪;并将该方法应用于E. aerogenes和Clostridium paraputrificum混合培养的模型体系,建立了定量两菌动态分布的方法。 对于E. aerogenes NADH产氢途径的机理研究发现,“NADH途径”包含NADH氧化酶和[NiFe]氢酶两个模块。NADH氧化酶位于细胞外膜,将细胞外NADH氧化为NAD+,同时产生电子。在厌氧状态下,质子为最终电子受体,电子直接通过细胞内膜上氢酶传递到胞内质子上最终生成氢气。在好氧状态,电子通过与氢酶有相同进化背景的Complex I最终传递到氧气生成水。部分纯化NADH氧化酶和氢酶确认了两模块在E.aerogenes中的存在,并研究了以上两酶的催化特性。 利用E. aerogenes整细胞NADH氧化酶的催化特点,通过E. aerogenes整细胞与ADH酶耦联实现辅酶NAD+再生,用于乙醇转化乙醛。此外,利用E. aerogenes和表面展示了手性醇脱氢酶(READH)的E. coli (pHLA-READH)进行双菌耦合,实现了整细胞间辅酶NAD+再生,用于转化苯乙醇为苯乙酮。 基于“NADH途径”分子机制,通过添加辅酶能够调控E. aerogenes氢气代谢。外源NADH使氢气转化率从1.42降到1.31 mol-氢气·(mol-葡萄糖)-1;而外源NAD+能够强化产氢代谢,使氢气转化率升高到1.52 mol-氢气·(mol-葡萄糖)-1。 通过E. aerogenes厌氧代谢网络模型计算确立敲除乳酸脱氢酶和乙醇脱氢酶强化“NADH途径”的策略,成功获取了E. aerogenes的ldh和adh基因,并将Red重组工程系统引入到E. aerogenes体系,实现了目的基因的敲除。


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