肌酸激酶的折叠及聚沉机理研究

【摘要】： 本文以肌酸激酶为折叠及聚沉模式蛋白质,研究了兔脑肌酸激酶(RBCK)、人脑肌酸激酶(HBCK)和兔肌肌酸激酶(RMCK)的折叠及聚沉机理。 研究了锌离子对RBCK和HBCK活力的影响,结果表明,低浓度的锌离子基本抑制了RBCK和HBCK的活力;高浓度的锌离子会引起RBCK和HBCK的聚沉,并且发现它们的聚沉是温度、酶浓度及锌离子浓度依赖性的。而且研究了甘油、蔗糖、甘氨酸和脯氨酸对锌离子引起的RBCK和HBCK聚沉的影响。结果表明甘氨酸和脯氨酸能防止聚沉,并且能部分恢复酶的构象和活力。 研究了RMCK的半胱氨酸残基修饰后的聚沉动力学过程。研究结果表明:在锌离子作用下,RMCK聚沉受不同pH值的调节。发现使用DTNB对酶活性部位的半胱氨酸残基的修饰会导致明显的剂量依赖的聚沉。该聚沉过程伴随转化自由能(ΔΔGAG)和疏水表面的变化,DTT、甘氨酸与脯氨酸能提高ΔΔGAG,减少RMCK聚沉,并能恢复RMCK活力。初步建立了阻止RMCK聚沉的方法。 研究了部分折叠的单体肌酸激酶(PF-CK)的折叠与聚沉。研究结果表明:由于PF-CK单体疏水表面相互作用,PF-CK发生聚沉。单体PF-CK能够在含环糊精和二巯基苏糖醇(DTT)溶液里正确再折叠。人工分子伴侣SDS-环糊精可防止聚沉,并再折叠PF-CK。这些聚沉及折叠途径遵循一级动力学过程。 以牛视网膜肌酸激酶链A(PDB entry:1G0W)为结构模板,预测了RBCK与HBCK高清晰度的三维结构,模拟了锌离子与脑型肌酸激酶之间、RBCK与丙烯酰胺之间、HBCK与SDS之间的对接实验。结构预测的研究结果为:锌离子、SDS及丙烯酰胺分别与酶的活性部位结合。SDS与HBCK上的ARG132、ARG320和ARG341结合,而RBCK的残基CYS74和GLY73可能与丙烯酰胺结合。 通过上述研究,进一步完善了肌酸激酶序列折叠途径,并且从空间结构上探索酶的结合方式,对肌酸激酶的聚沉机理及神经衰退性疾病的关系进行了探讨。