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基于微流控技术体外构建神经元网络的相关研究

田姗姗  
【摘要】:在体外构建一个与大脑具有相同类型细胞和相似功能的神经元网络,并在可控的环境下分析神经元网络功能,对于获得神经系统学习、可塑性和信息处理的基本规律具有重要意义。本文重点开展了基于微流控技术及微电极技术体外构建神经元网络的相关研究,根据神经元网络的研究现状,提出了基于微流控技术的体外神经元网络构建方法,并在此基础上完成了神经元网络结构形态及自发放电的检测及分析。具体研究内容包含以下几个部分:1、根据神经元细胞的特异性结构完成神经元网络培养芯片的设计及加工。芯片尺寸为10x10x5mm,结构包括进液口、出液口、细胞培养室。细胞培养室结构为10x10微阵列网络,微通道宽度为100μm,深度为40μm。2、探究适用于构建神经元网络的最佳密度,获得高质量的离体神经元网络。实验中,在芯片上接种1x10~5cells/ml、5x10~4cells/ml、2x10~4cells/ml三个密度的神经元细胞,显微镜下隔天观测神经元网络生长状态。最后进行死活染色实验,检测实验所设计芯片上神经元网络的增殖活性。结果表明细胞密度为5x10~4cells/ml的神经元网络生长状态最好,且细胞存活率超过99%。3、采用免疫荧光技术完成神经元网络结构形态学的定性分析。实验中,采用β-微管蛋白-Ⅲ抗体(Tubulin)、微管相关蛋白-2抗体(MAP-2)标记神经元的细胞胞体及突起结构。激光共聚焦显微镜检测结果表明神经元细胞生长在微通道内,细胞核大且圆,结构清晰,细胞突起沿着通道方向生长,之间交错形成神经元网络。采用Image J软件对神经元网络进行定量分析,测得神经元突起平均长度约为68.3μm,通过Sholl analysis分析神经元复杂性,追踪得到神经元结构位图,并使用不同函数进行拟合,验证结果准确性。4、采用微流控技术及微电极技术完成神经元网络电生理检测平台的设计及加工,其中微流控芯片限定神经元细胞生长区域,增强神经元细胞与微电极的耦合效果。微电极芯片实现神经元细胞的培养及电信号检测,微电极芯片基底为玻璃材料,尺寸大小为49x49x1mm,微电极呈8x8排列,包括59个工作测量电极和1个参比电极。5、MEA微电极检测系统完成神经元网络电生理的检测。系统硬件包括:前端信号检测系统、数据接口模块、温控系统、PC和软件处理。检测得神经元网络自发放电信号,波形时程小于3ms,幅值为50μv~2mv。神经元网络存在三种放电模式,分别为持续爆发模式、单个锋电位与爆发交替发放模式、连续发放的单个峰电位模式,实验中24号通道检测电位为持续爆发模式。神经元细胞之间锋电位的传导在时间上存在延时,但电极模式可以被准确传导,且神经元的活动不是单个的、杂乱无序列,而是神经元之间相互协同的结果。


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