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色氨酸羟化酶-2在大肠杆菌中的表达及其毕赤酵母表达菌株的构建

陈京顺  
【摘要】:5-羟基色氨酸(5-HTP)是一种重要的抑制性神经递质5-羟色胺(5-HT)的前体物,是脑部控制情绪、行为、睡眠、食欲的重要化学物质。5-HTP不仅成功的应用于抗抑郁、失眠的治疗上,也可有效帮助产生饱足感,从而降低食欲,具有一定的减肥功效。 色氨酸羟化酶-2(TPH-2)是5-HT合成过程中的限速酶,直接催化色氨酸生成5-HTP。本研究首次通过外源表达获得了TPH-2蛋白,具有重要的学术价值并可能成为工业生产5-HTP的新的重要途径。 本研究主要致力于来源于人的TPH-2基因在大肠杆菌表达体系中的表达及在毕赤酵母表达体系中表达载体的构建整合。研究中构建了原核表达载体pET32a-TPH、PGEX-4T-1-TPH和毕赤酵母表达载体pPICZa-TPH和pPIC3.5k-TPH,并分别在大肠杆菌BL21(DE3)表达体系和毕赤酵母表达体系中进行了重组蛋白表达的研究。在大肠杆菌表达体系中,通过两个载体分别成功的首次表达出了具有his标签的融合蛋白和具有Gst标签的融合蛋白。在毕赤酵母表达系统中,也首次成功的将目的基因整合至毕赤酵母基因组中,构建了稳定的外源蛋白表达的工程菌。 在微物转化色氨酸生产5-HTP的研究中,筛选了40株霉菌、十余株放线菌及从加纳籽中分离纯化的未知菌株。首先通过分批培养转化法在微生物生长对数期添加底物进行底物转化,同时为防止微生物自身代谢体系对底物色氨酸的利用,通过使用静息细胞转化的方法进行了微生物转化,此种方法可以减少因微生物自身代谢而消耗的色氨酸。即将培养后的微生物离心获得菌体,将菌体分散在含有底物的生理盐水中进行对底物的转化。通过两种微生物转化色氨酸生成5-HTP方法的研究,初步探索了微生物转化色氨酸生产5-HTP的能力,为后人开展生物转化生产5-HTP奠定了基础。 为了深入研究5-HTP的生理功能,开展了通过小鼠实验验证5-HTP抑制食欲,帮助减肥的功能的研究。通过与阳性对照和空白对照的比较,小鼠每天两次,在喂食前一小时每次灌胃0.5mL浓度为0.1mg/mL的5-HTP,经过为期7d的饲养,经过观察与统计发现,与灌胃生理盐水的小鼠体重增加了7.4%相比,灌胃5-HTP的小鼠体重总体下降了2.5%。证明了5-HTP具有一定的抑制食欲、帮助减肥的功效。


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