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混合固态发酵法生产β-木糖苷酶及其酶学性质研究

田海源  
【摘要】:β-木糖苷酶是木聚糖酶系的重要组成成分,它以外切的方式作用于低 。聚木糖的非还原性末端,从而实现低聚木糖到木糖的转化。本课题首次使用黑曲霉和绿色木霉的诱变菌株进行混合固态发酵产β-木糖苷酶,并对固态发酵条件和所产β-木糖苷酶的酶学性质进行了深入研究。 首先通过紫外诱变,菌种复筛和驯化手段,得到了遗传稳定的黑曲霉和绿色木霉的正突变菌株,产β-木糖苷酶能力分别提高了70%和50%。且发现混合发酵产酶要优于单菌株发酵,β-木糖苷酶活力提高了33%。混合发酵最适产酶条件:玉米芯和麸皮总质量为10g,质量比为1:1,黑曲霉和绿色木霉接种体积比为2:3,0.3mg·mm~(-1)Ca~(2+),1%低聚木糖,35℃培养6d,可使酶活力达到最高,为0.25U·mg~(-1)。用玉米芯和麸皮来进行固态发酵,降低了成本,具有环保和经济两方面的优势。 β-木糖苷酶粗酶液经硫酸铵沉淀、热处理、Sephadex G-100凝胶柱层析和DEAE-52阴离子交换柱层析纯化后,比酶活达到了21.85U·mg~(-1),β-木糖苷酶的回收率为14.5%,纯化倍数达到了91.0倍,纯化结果较好。对纯化后的酶进行了电泳,得出木糖苷酶的蛋白亚基分子质量在130kD左右。 β-木糖苷酶酶学性质研究结果表明,该酶的最适合pH值为5.0,pH稳定范围为4.5-7.5,最适温度为45℃。对该酶活力有促进作用的离子有Ca~(2+)、Na~(+)、K~(+)和EDTA,而Co~(2+)、Cu~(2+)、Ni~(+)对该酶有很强的抑制作用。且该酶表现出良好的木糖耐受力和有机毒素耐受力。该酶酶解pNP-β-Xylopyranoside的Km值为0.051mmol·L-1, Vm值为0.41mmol·min–1·mg~(-1)。该酶仅对pNP-β-Xylopyranoside有很好的酶解效果,具备很强的底物专一性。酶解条件实验证明了该酶与木聚糖酶之间存在良好的协同促进作用,混合酶解液可以将90%的木聚糖完全降解,且混合酶水解液中木糖含量要超过单一酶水解液50%。


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