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基于刀豆蛋白—糖亲和力的葡萄糖响应性胰岛素递送载体

殷瑞雪  
【摘要】:糖尿病是一种严重的终身性疾病(分为I型和II型),表现为持续高血糖,主要病因是胰岛β细胞受损而引起的胰岛素绝对或相对分泌不足,已经成为严重危害人类健康甚至生命的疾病。糖尿病(尤其是I型,即胰岛素依赖型)最有效的治疗方法是每天几次皮下注射胰岛素,从而帮助人体控制血糖维持在正常水平。不幸的是,这种广泛应用的治疗方法亦不能很好的控制血糖,常常会引发低血糖等急性并发症,严重时甚至晕厥、休克。因此寻求更有效舒适的治疗方法非常迫切。目前人们致力于开发新的胰岛素递送体系,包括新的递送路线(如口服给药),新的胰岛素剂型等。 本课题利用伴刀豆球蛋白(ConA)与糖单元的特异性亲和力制备具有葡萄糖响应性的水凝胶/微凝胶载体用于胰岛素的自调节递送(即模拟胰岛的分泌胰岛素功能,根据血糖浓度变化能够自动调节胰岛素释放量)。为了限制体系溶胀过程中ConA的流失从而保持持久的葡萄糖响应性以及避免组织免疫反应,我们通过共价键将Con A固定到其聚合物配体中;而在固定Con A过程中为了提高效率,最大程度地保持其生物活性并减少损失,我们设计了同时具备Con A亲和位点以及交联位点的壳聚糖基聚合物配体,以便直接通过交联剂与未改性的Con A交联固定;同时壳聚糖基聚合物配体的引入也提高了载体对于胰岛素的载药能力,延长了胰岛素的反复葡萄糖响应性释放时间。具体内容如下: 1、采用迈克尔加成反应对Con A改性使其带有可反应性碳碳双键,从而通过双键交联将Con A固定到聚合物配体中。首先将具有活性双键的Con A-E与同样具有活性双键的聚合物配体右旋糖酐Dex-G通过紫外光交联制备了水凝胶。使用红外光谱、氢核磁来表征了改性产物Dex-G、ConA-E以及所得水凝胶的结构,使用荧光光谱确认了改性后Con A的活性。此外,分别通过溶胀测试、组分流失测试及扫描电子显微镜研究了体系的葡萄糖敏感性、凝胶组成对性能的影响、Con A改性后的优势以及不同条件下水凝胶的表面结构。结果表明对Con A改性并与Dex-G共价交联制备的水凝胶能够保持一定的葡萄糖敏感性并且有效地降低Con A在溶胀过程中的组分流失。 2、在Con A-E/Dex-G水凝胶基础上通过反相乳液分散交联的方法制备了载有胰岛素的微凝胶载体。实验中详细研究了微凝胶在不同葡萄糖浓度环境中的胰岛素释放行为以及Dex-G的取代度对微凝胶胰岛素释放行为的影响,并将释放数据与经典的指数模型拟合,探究了其释放速率以及表面突释效应。结果表明该微凝胶能够可逆且重复地响应环境中葡萄糖浓度的变化而调节胰岛素释放量;Dex-G的取代度影响微凝胶的葡萄糖响应性、胰岛素释放速率以及表面突释。此外,从微凝胶中释放出的胰岛素依然保持活性,且微凝胶对L929细胞没有毒性。 3、考虑到糖尿病人特殊的生理环境,开发了一种能够同时响应环境中葡萄糖浓度变化以及较小的pH值改变而调节胰岛素释放量的载体。我们使用Con A-E/葡萄糖氧乙基甲基丙烯酸酯(GEMA)的复合物与甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)光聚合制备葡萄糖/pH双敏感性微凝胶载体,详细研究了微凝胶响应环境中不同葡萄糖浓度以及较小pH变化的体外胰岛素释放行为,使用经验公式研究了释放动力学,并通过费克第二定律在简单边界条件下的变形公式计算了体系的表观扩散系数。结果表明该微凝胶能够响应环境中葡萄糖浓度的变化以及较小的pH值改变而调节胰岛素释放量,但是反复响应性不强。所释放出的胰岛素依然保持活性。 4、为了避免Con A改性过程中的损失,降低成本,我们以戊二醛为交联剂将未改性的Con A直接偶联到壳聚糖微粒上,最后通过特异性亲和作用在表面沉积右旋糖酐。通过扫描电子显微镜、荧光显微镜、X射线光电子能谱以及热重分析表征了微粒的形貌和化学组成,并研究了胰岛素的体外释放行为以及活性。该复合凝胶微粒对于胰岛素具有较高的包封率;能够可逆且重复地响应环境中葡萄糖浓度的变化而调节胰岛素释放量,然而其持续响应性释放能力有待进一步提高;从微粒中释放出的胰岛素依然保持活性。 5、为了进一步提高Con A固定效率、体系的生物相容性以及胰岛素载药和释放能力,我们设计了同时具备Con A亲和位点以及交联位点的壳聚糖基聚合物配体-葡萄糖氧乙基丙烯酸酯改性壳聚糖(CS-GEA),采用生物相容性良好的天然产物京尼平为交联剂通过反相乳液分散交联的方法制备了CS-GEA/Con A微凝胶,研究了微凝胶的载药行为、不同葡萄糖浓度的环境中的胰岛素的释放行为,并通过与经典指数模型的拟合研究了释放速率和突释效应,对释放出的胰岛素的活性以及微凝胶的体外细胞毒性也进行了表征。结果表明微凝胶具有较高的载药量和包封率,其胰岛素载药过程受环境pH值的影响;其根据葡萄糖浓度变化可重复响应性释放胰岛素的释放时间与之前的体系相比大大延长,且其药物释放行为受表面突释效应影响非常小;此外,从微凝胶中释放出的胰岛素依然保持活性,且微凝胶对L929细胞没有毒性。


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