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骨组织工程明胶支架和种子细胞骨髓间充质干细胞(BMSCs)的改进研究

张艺凡  
【摘要】:骨组织工程中细胞支架和种子细胞是非常重要的两部分。对于细胞支架来说,能与原位组织牢固结合,能够实现骨组织的快速再生,并且能够在骨修复过程中保持良好的力学性能的细胞支架是现在骨组织修复中所需要的。因此,本论文对骨组织工程中常用的水凝胶支架进行了改进,采用双键化明胶(GelMA)与无机物羟基磷灰石纳米线(HANW)复合的方法得到了 GelMA/HANW复合晶胶和水凝胶,对两种细胞支架进行了表面形貌、细胞相容性、力学性能和体内骨修复能力的对比研究,确定优化的、更适用于骨组织工程的复合晶胶支架。对于种子细胞BMSCs来说,电刺激(Electrical Stimulation,ES)是一种可以促进其成骨分化的方法,为了能够更好地理解电刺激对BMSCs分化的影响,本论文改进了电刺激设备,采用聚左旋乳酸(PLLA)与多壁碳纳米管(MWCNTs)复合和在聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)表面聚合聚吡咯(PPy)的方法制备了两种导电基底,将电刺激设备和导电基底结合筛选出了合适的电刺激参数,系统地探究了电刺激、导电基底和分化诱导培养基对BMSCs分化行为的影响。主要发现如下:(1)作为骨组织工程支架,相对于GelMA/HANW水凝胶,改进制备的GelMA/HANW晶胶显示出独特的优势:GelMA/HANW水凝胶内部孔径仅为36.4±8.1 μm,呈现脆性,在压缩测试中易碎,而采用相同原料改进制备的GelMA/HANW晶胶具有贯穿大孔结构,孔径达到143.7±32.1μm,可承受60%应变的压缩变形,循环压缩稳定性好,形状恢复能力出色;细胞培养和大鼠颅骨再生实验结果显示,小孔径的GelMA/HANW水凝胶支架阻碍细胞的迁移和铺展,不利于新生骨组织长入,和周围骨组织之间存在间隙,且随着体内植入时间延长,水凝胶支架发生碎裂,而具有贯穿大孔结构的GelMA/HANW晶胶支架利于细胞和组织进入生长,与周围骨组织形成紧密结合,在植入体内12周后,晶胶支架仍能维持稳定的三维多孔结构,为骨再生修复提供力学支撑和适宜的微环境。(2)作为骨组织工程种子细胞,相对于传统传代培养的BMSCs,经电刺激预处理再传代培养的BMSCs显示出增强的成骨分化潜能:在确定优化的电刺激参数(PPy/PET导电基底,10Hz,50mV/mm,1h/day)下,分别在增殖培养基、成骨诱导培养基和成软骨诱导培养基中,给予BMSCs电刺激,再进行传代培养,检测成骨分化和成软骨分化相关基因的表达水平,结果显示,在增殖培养基中给予电刺激预处理的BMSCs,在传代培养后其成骨分化潜能增强;在成骨诱导培养基中给予电刺激预处理的BMSCs,在传代后培养后其成骨分化潜能下降;电刺激对BMSCs成软骨分化潜能影响不明显,但经成软骨诱导培养基培养的BMSCs,在传代培养后其成软骨分化潜能得到提高。以上结果显示,本论文对于明胶支架和种子细胞BMSCs的改进研究,均取得了促进成骨分化和骨组织再生的效果,两者的结合应用,预期将显著加速骨缺损再生修复和功能重建。


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