利用毕赤酵母发酵表达植物甜蛋白（Brazzein）的初步研究

【摘要】：近年来从非洲植物中提取出了一些甜味蛋白，作为一种天然非糖类的甜味剂,其具有高甜味、低热卡、无毒安全、多功能等优点, 不会导致龋齿和肥胖症，糖尿病患者也可以食用。但是由于提取资源有限，利用基因工程的方法生产甜味蛋白，具有重要的现实意义。 本文研究的植物甜蛋白（Brazzein）是甜味蛋白中分子量较小的一员，仅为6.4kD，由54个氨基酸残基组成，它的相对甜度是蔗糖的2000倍，而且具有良好的热稳定性。已有人成功的利用大肠杆菌和转基因植物实现了表达。毕赤酵母是一种可以以甲醇为唯一碳源的非常规酵母，具有强有力的AOX启动子，可将外源基因整合到宿主的染色体上，继代十分稳定，蛋白可以分泌表达，实现高密度发酵，因此毕赤酵母是一种高效蛋白表达体系。本文采用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastori）GS115作为宿主菌进行了表达植物甜蛋白（Brazzein）的初步研究。 将含有Brazzein基因的pPIC9K穿梭质粒电导入巴斯德毕赤酵母（Pichia pastori）GS115中,并从22个His＋Muts阳性克隆中筛选出高拷贝转化子2个，将其诱导分泌表达的产物进行Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定，目标蛋白分子量与理论值一致；对发酵条件进行了优化，采用YPG作为种子液，确定了微量元素加入量为4ml/L，6％（w/v）的甘油，（NH4）2SO4 10g/L的培养基新配比，在28℃、pH5.0下培养，每24h加入0.5％(v/v)的甲醇进行诱导为最佳。该条件用于指导小试（5L/10L罐），蛋白表达量达到了385mg/L；采用等电沉淀、大孔树脂、 WP=4 凝胶层析和几种阴、阳离子交换柱的方法对发酵液进行了初步分离研究。强阳离子交换层析SP Sepharose FF用含有0.4MNaCl的20mmol/L、pH4.1 NaAC-HAC缓冲体系洗脱可得到有微甜味的产物，对产物采用Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定分子量一致，采用600-MHZ1H NMR核磁共振，与文献报道大肠杆菌表达的重组甜蛋白600-MHZ1H NMR核磁共振谱图比较，主要官能团的化学位移基本一致，该结果进一步证实植物甜蛋白Brazzein在毕赤酵母中也得到了正确表达。