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Hepcidin 20基因克隆及在毕赤酵母中的表达

张慧(Farzana Rashid)  
【摘要】:Hepcidin是一种低分子量的富含半胱氨酸的肝脏多肽激素,最初从人类血浆和尿液中分离得到。Hepcidin对体内铁稳态有重要调节作用,hepcidin的缺乏会导致多种疾病。另外,hepcidin在体外表现出良好的抗细菌及真菌活性。化学合成及从组织中提取hepcidin成本较高且存在许多困难。至今,对于在真核生物中表达像hepcidin这样的小分子多肽的报道还很少。 酵母像细菌一样容易进行连续培养,与高等动物表达蛋白的方式相似,因此在本研究中我们希望在酵母中高效表达有活性的重组hepcidin,在本研究中,我们在毕赤酵母中表达了人类hepcidin多肽,并对表达条件进行了优化。 根据hepcidin的氨基酸序列以及毕赤酵母中密码子的偏好性,合成了全长的hepcidin基因,克隆到酵母表达载体pPIC9K上并转化毕赤酵母GS115菌株。在涂有合适浓度的遗传霉素抗性平板上筛选转化予,并经PCR验证。在MM和MD平板上鉴定转化子表型,验证后发现均为His+Mut+。 重组毕赤酵母菌株在BMGY培养基中培养(28℃,260 rpm),每24h加入0.5%的甲醇诱导。转化空pPIC9K质粒的菌株作为对照。Tricine-SDS-PAGE显示2.2kD条带,表明异源蛋白在毕赤酵母中成功表达。多肽表达水平和活性分别通过SDS-PAGE和免疫反应检测。 对重组酵母的培养及诱导条件进行了优化。结果表明胰蛋白胨,酵母提取物,稳定的PH对重组酵母生长和蛋白表达有显著影响。28℃0.5%的申醇诱导48h,BMMY培养基与其他培养基相比(BMM和MM)最适合hepcidin表达。 收集诱导60 h的发酵液,重组多肽通过等电点沉淀和凝胶过滤色谱纯化。含有hepcidin的部分通过反向HPLC进一步纯化。另外,Hepcidin(11min)洗脱时间与化学合成的hepcidin相同。Hepcidin的分子量与计算的分子量(2191.77Da)一致。收集的每一部分通过ELISA验证是否含有重组Hepc,并验证得到的物质确实为hepcidin。 另外,LC.ESI-MS图谱显示2192.0 Da的hepcidin分子离子峰。最后重组hepcidin对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有明显的抗菌活性。


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