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酶膜反应器制备燕麦ACE抑制肽和抗氧化肽的研究

张晓平  
【摘要】:燕麦麸蛋白是优质的蛋白质资源,它的开发和利用具有重要的意义,并且生物活性肽的开发和利用是当今社会的研究热点,也是未来保健品开发的趋势,同时,酶膜反应器在结构设计和操作流程上的优点是其他反应器无可比拟的,其在生物活性肽制备方面将有广阔的应用前景。因此,本课题决定采用酶膜反应器酶解燕麦麸蛋白制备ACE抑制肽和抗氧化肽,为燕麦麸的深加工、生物活性肽的制备和酶膜反应器的应用提供一定的试验依据。 本文主要研究了燕麦麸蛋白的不同提取方法及不同提取方法所提取燕麦麸蛋白的营养价值、中空纤维膜对燕麦麸蛋白的分离纯化、酶膜反应器制备燕麦ACE抑制肽和抗氧化肽的工艺及燕麦活性肽的分离纯化,具体结论如下: 通过单因素和正交试验分别优化了碱法、超声辅助碱法及超声辅助酶碱法提取燕麦麸蛋白的最佳工艺,在最佳条件下燕麦麸蛋白的提取率分别可达31.96 %、39.31 %、61.43 %。根据燕麦麸蛋白在不同pH值下的溶解性及沉淀率,确定碱法、超声辅助碱法和超声辅助酶碱法所提燕麦麸蛋白的等电点分别为4.6、3.6、3.8,沉淀率分别为57.92 %、63.24 %、72.24 %。通过氨基酸组成分析和营养价值的评定,可知3种提取方法所提取的燕麦麸蛋白均符合FAO/WHO推荐的模式,且3种提取方法所提取燕麦麸蛋白的EAAI基本一致,说明3种提取方法所提取燕麦麸蛋白的营养价值相当。 以燕麦麸蛋白回收率、总糖清除率、膜的污染度、浓缩效率及膜通量恢复率为指标,优化了中空纤维膜分离燕麦麸蛋白的工艺参数及膜的清洗方案。在温度35℃、操作压力0.02 MPa、pH值=8、流量25 L/h条件下,利用中空纤维膜MOF503分离经滤纸过滤的燕麦麸蛋白提取液,燕麦麸蛋白回收率、总糖清除率、膜的污染度及浓缩效率分别为80.3 %、79.5 %、41 %、43.5 L/(m2?h),同时,若采用分批超滤方式并辅以定期在线负压反冲清洗更有利于MOF503超滤处理燕麦麸蛋白提取液。通过物理和化学清洗方法对MOF503清洗效果的研究,可知物理清洗中的负压反冲清洗效果要明显优于等压水力清洗、化学清洗中HCl(pH值=2)和NaOH+H2O2+HCl比其他的清洗效果要好,若物理和化学清洗协同作用,可使MOF503膜通量恢复率达94.74 %。该研究结果表明利用中空纤维膜分离燕麦麸蛋白是可行的,并且将为膜分离蛋白的研究提供一定的技术依据。 通过对Alcalase、Trypsin、Pepsin酶解燕麦麸蛋白所制备产物的ACE抑制活性、抗氧化活性及产物得率的研究,确定Alcalase作为酶解燕麦麸蛋白制备活性肽的初步用酶,并在Alcalase单酶作用的基础上研究Alcalase+Trypsin、Alcalase+Pepsin耦合酶解燕麦麸蛋白对产物活性的影响,最终确定在研究酶膜反应器制备燕麦活性肽工艺的过程中不考虑分步酶解作用,并通过研究Alcalase对燕麦麸蛋白的酶解速度,可知Alcalase酶解燕麦麸蛋白速度的降低主要是由于底物消耗和酶活损失共同造成的。同时,通过研究酶膜反应器系统对酶活的影响,可知酶膜反应器系统对Alcalase具有很好的保留效果,其中蠕动泵运转过程对酶造成的破坏和超滤膜对酶的吸附是导致Alcalase酶活损失的主要原因。 通过DPS软件设计均匀试验方案和SPSS软件处理试验数据,求得在利用酶膜反应器酶解燕麦麸蛋白制备活性肽过程中酶活保留率和多肽生产效率均取较大值时各因素的水平条件:底物浓度3 %、加酶量3 %、料液流量45 L/h、操作压力0.06 MPa、温度60℃、pH值=7,在该条件下酶膜反应器对Alcalase酶活的保留率达92.86 %、多肽生产效率达1 896.5 mg/(m2·h)。通过利用Design Expert 6.0.5设计四因素三水平的响应面分析试验,求得酶膜反应器制备燕麦ACE抑制肽的最佳工艺条件为底物浓度3 %、加酶量3.5 %、料液流量45 L/h、操作压力0.07 MPa、温度61℃、pH值=8,在该条件下产物的ACE抑制率可达67.86%。同时,求得酶膜反应器制备燕麦抗氧化肽的最佳工艺条件为底物浓度3 %、加酶量3.2 %、料液流量45 L/h、操作压力0.07 MPa、温度55℃、pH值=7.3,在该条件下产物的DPPH清除率可达57.39 %。 通过研究活性炭对燕麦麸蛋白酶解液的脱色工艺,确定活性炭YD-303为最佳脱色剂,其对燕麦麸蛋白酶解液的最优脱色工艺条件为:添加量1.5 %、pH值=3.5、温度40℃、时间75 min,在该条件下脱色率和多肽回收率分别可达85.36 %和83.79 %。通过研究证明,利用大孔吸附树脂对燕麦麸蛋白酶解液进行脱盐处理是行之有效的方法,并确定大孔吸附树脂DA201-CⅡ对燕麦活性肽的吸附性能要优于其它七种树脂,其最佳操作工艺为:将pH值=4.0、多肽浓度为39 mg/ml燕麦麸蛋白酶解液以1 BV/h的流速上样、1 BV/h的流速水洗、1.5 ml/min 75 %乙醇解吸,在该条件下大孔吸附树脂DA201-CⅡ对燕麦麸蛋白酶解液的脱盐率和多肽回收率分别达93.4 %、72.3 %。同时,根据不同浓度乙醇洗脱DA201-CⅡ所获得组分的活性变化情况,可知能够利用洗脱剂极性的不同达到分级纯化的目的,其中ACE抑制肽利用75 %乙醇洗脱所获得组分活性最高,ACE抑制率可达91.7 %,而抗氧化肽利用95 %乙醇洗脱所获得组分活性最高,DPPH清除率可达35.01 %。 虽然DA201-CⅡ能够通过洗脱剂极性的大小对ACE抑制肽和抗氧化肽达到分离纯化的目的,但是,由于DA201-CⅡ本身存在的缺陷及洗脱剂极性难于控制等问题,其还不能分离出较高纯度的活性肽,故还需要利用葡聚糖凝胶、反相高效液相色谱、液质(HPLC-MS)联用仪等分离手段对ACE抑制肽和抗氧化肽进一步分离纯化,最终分离出结构单一的活性肽。


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