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喹烯酮致HepG2细胞毒性与凋亡的分子调控机理研究

张朝明  
【摘要】:喹烯酮(Quinocetone)属喹噁啉-1,4-二氧化物,是我国首创的一类新兽药,具有抗菌、止泻和促生长作用,目前己广泛应用于养猪业中。同类药物中的卡巴氧和喹乙醇由于具有遗传毒性和潜在的致癌作用,己被世界上许多国家禁止或限用做动物饲料添加剂。具有相同母核结构的喹烯酮体内外实验均显示出一定的遗传毒性,但其毒性作用机理仍不清楚。本研究以体外培养的具有代谢酶活性的人肝癌HepG2细胞为模型,研究喹烯酮的细胞毒性作用及其产生机制,分析喹烯酮对HepG2细胞全基因组表达谱的影响,探讨喹烯酮诱导HepG2细胞凋亡的分子调控机理,为评估喹烯酮对食品动物和人的安全性提供理论依据。 MTT试验结果表明喹烯酮能抑制HepG2细胞的增殖,24h和48h的IC50值分别为9.2μg/ml和6.7μg/ml。LDH释放试验显示喹烯酮能促使HepG2释放乳酸脱氢酶。流式细胞术检测发现喹烯酮对HepG2细胞具有显著的周期阻滞作用,低浓度喹烯酮使细胞阻滞于S期,高浓度时阻滞于Go/G1期。普通光学显微镜观察、Hoechst33342/PI染色观察及Annexin V-FITC/PI双染法流式检测结果表明喹烯酮能够诱导HepG2细胞凋亡。MDC染色、透射电子显微镜观察和流式细胞术检测证明喹烯酮诱导HepG2细胞发生自噬。以上结果表明喹烯酮具有明显的细胞毒性作用。 应用特异性荧光染料DCFH-DA和DHE检测喹烯酮处理HepG2细胞内ROS含量的变化,结果表明喹烯酮能呈剂量依赖性地诱导细胞内ROS含量增加。同时,细胞免疫化学方法检测到喹烯酮染毒细胞内DNA氧化损伤标志物-8-OHdG的含量增加。抗氧化剂NAC和GSH能够降低喹烯酮诱导的ROS含量升高,提高药物染毒细胞的活力,缓解喹烯酮所致线粒体膜电位的下降,显著抑制喹烯酮诱导的细胞凋亡。Western Blot试验结果显示NAC能够抑制Caspase-8和-3、Bid及PARP-1前体蛋白的剪切以及Bax/Bcl-2比值的升高,对JNK和p38MAPK磷酸化水平也具有显著的抑制作用。表明喹烯酮的细胞毒性可能与氧化应激反应有关。 采用Agilent公司人全基因组表达谱芯片检测喹烯酮处理HepG2细胞全基因组表达谱的改变,共筛选出6202个表达差异基因,其中表达上调3909个,表达下调2293个。差异基因所属GO条目4877个,pathway条目903个。结果显示喹烯酮的细胞毒性作用涉及多种代谢和信号途径,包括:细胞代谢、细胞周期、DNA复制与损伤修复、细胞凋亡、氧化应激、MAPK通路、p53信号途径、mTOR信号通路等。其中,与细胞凋亡调控有关的差异基因分布于外源性和内源性凋亡途径中,涉及对DNA损伤与修复的调节和细胞增殖相关基因的转录调控。 最后,我们对喹烯酮诱导HepG2细胞凋亡的分子调控机理进行了研究。TUNEL法流式检测结果表明喹烯酮能使细胞DNA发生片段化。Western Blot、RT-PCR和Caspase活性检测结果显示,喹烯酮所致凋亡过程伴有Caspase-8、-9和-3的激活。流式检测结果也表明广泛性Caspase抑制剂及Caspase-3、8和-9特异性抑制剂显著地抑制喹烯酮诱导的细胞凋亡。线粒体凋亡途径相关试验研究结果发现,喹烯酮能使细胞线粒体膜电位下降,促进细胞色素C的释放,Bax mRNA和蛋白水平上升,Bcl-2mRNA和蛋白水平下降,PARP-1蛋白发生剪切;Western Blot结果显示TNFR1、TNF-α、Fas和FADD蛋白含量增加,Bid蛋白发生剪切。RT-PCR结果表明TfNFR1、 TNF-a和Fas的mRNA水平升高。TNFR1/Fc受体阻断剂能抑制喹烯酮诱导的细胞凋亡,表明死亡受体途径也参与调节喹烯酮诱导的细胞凋亡。Western Blot检测结果表明p53、p21、p-p38和p-JNK蛋白水平增加,参与对喹烯酮所致凋亡的调控。上述结果表明喹烯酮对HepG2细胞凋亡的调控过程涉及Caspase的激活,TNF-a和TNFR1的信号转导,Bcl-2家族蛋白的调节,以及p53,p38和JNK信号通路的参与。 综上所述,喹烯酮对HepG2细胞具有细胞毒性,产生机制可能与氧化应激有关,可影响细胞内多种代谢通路,通过线粒体和死亡受体途径诱导细胞凋亡。


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