利用反向代谢工程技术探究酿酒酵母氧化胁迫应答机制

【摘要】：氧化胁迫会导致酵母细胞内脂类、蛋白质和DNA等生物大分子物质发生氧化变性、交联或断裂,从而引起细胞结构和功能的破坏,最终导致酵母菌的发酵特性下降。本研究采用反向代谢工程技术“从细胞表型到基因型”的研究策略,结合全转录工程技术对酿酒酵母BY4741进行了分子改造,提高了其抗氧化胁迫能力；并利用转录组测序技术对细胞氧化胁迫应答反应中的关键基因进行了识别；通过对关键基因开展GO和KEGG富集分析,获得了差异表达基因的功能及其所参与的代谢途径,深入系统的研究了酿酒酵母的氧化胁迫应答机制。主要结论如下： (1)将穿梭载体pYES2上的诱导型启动子GAL1替换成组成型启动子ADH1,成功构建表达载体pZHW4。 pZHW4全长大小6.14kb,携带有ADHl启动子和CYC1终止子。 (2)采用多轮连续易错PCR的方法对酿酒酵母的两个通用转录因子编码基因SPT15和TAF25进行随机突变,并将目的基因与载体pZHW4连接,分别构建重组载体pZHW4-spt15和pZHW4-taf25。通过电转化方法,将重组载体导入酿酒酵母BY4741细胞内,成功构建转录因子突变文库,文库容量约为1×105cfu/mL,用于抗氧化突变株的大规模筛选。 (3)在H2O2存在的条件下,成功筛选到两株抗氧化表型突变株：菌株spt15-5和taf25-3。在含有1.5mMH2O2的培养基中培养12h,菌株spt15-5和tar25-3的生物量分别比空载体对照株C3高出83.3%和50%。 (4)随进突变的转录因子出现了多个氨基酸突变位点。在spt15-5上出现了5个突变位点(S136R、 K138、R141G、G147R、K167N);在taf25-3上出现了6个突变位点(D106Y、R108Q、 Q158R、 P160T、 K180I、L188P)。 (5)突变菌株spt15-5和taf25-3细胞内的ROS含量显著低于对照菌株,分别下降了52.86%和89.36%；并且在氧化胁迫条件下,突变菌株细胞内CAT和SOD的酶活均显著提高。在菌株spt15-5细胞内分别提高了54.3%和38.4%；在菌株tar25-3细胞内分别提高了37.9%和67.7%。 (6)模拟酒精发酵,在氧化胁迫条件下,突变菌株taf25-3的生长速度显著高于对照菌株,延滞期缩短,提前12h进入对数期,并且菌株tar25-3的酒精产率较对照菌株提高了25.5%,缩短了发酵时间。 (7)氧化胁迫条件下,突变菌株与对照菌株之间共有1006个差异表达基因,其中有15个基因属于转录因子编码基因。同时,利用Realtime PCR技术对部分已确定的关键基因进行了验证,试验的结果与高通量测序结果一致。差异表达的基因主要参与的代谢途径有核糖体的合成、rRNA代谢、RNA的合成、碳源代谢过程、脂肪酸降解、过氧化物酶复合体的合成、氨基酸的合成、MAPK信号转导途径和PKA信号传导途径。 本研究丰富了对酵母细胞氧化胁迫应答分子机制的认识,为酿酒酵母优良菌株的筛选和改良提供了理论依据。