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苯醚甲环唑对斑马鱼毒性及作用机制研究

穆希岩  
【摘要】:随着人们对农药的环境负面作用认识的提高,农药环境安全性评价工作已成为农药科学合理施用的基础。鱼类作为生态系统中的重要生物,同时又是人类的主要食物,农药对鱼类的毒性评价工作一直是农药环境评价的重点。 三唑类农药是目前使用量很大的—类杀菌剂,苯醚甲环唑作为一种有代表性的三唑类杀菌剂,被广泛应用于各类农作物病害的防治。在中国,苯醚甲环唑更是防治水稻病害的主要农药。因此评价其对水生生物的毒性非常重要。 本论文结合形态学、生物化学和分子生物学手段,研究苯醚甲环唑对不同生命阶段斑马鱼的毒性及作用机制:1.苯醚甲环唑对斑马鱼急性毒性 苯醚甲环唑对斑马鱼成鱼、胚胎和仔鱼的96h LC50值分别为1.45mg/L、2.34mg/L和1.17mg/L。该结果表明,斑马鱼不同生命阶段对苯醚甲环唑的敏感性顺序为:仔鱼成鱼胚胎。2.苯醚甲环唑对斑马鱼胚胎发育影响将斑马鱼胚胎分别暴露于0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/L的苯醚甲环唑水溶液中。6天发育试验结果表明,苯醚甲环唑能够在斑马鱼胚胎发育过程中引起一系列的不良影响,包括孵化抑制、心率下降、自主运动异常、生长抑制以及多种致畸作用。为进一步探究苯醚甲环唑引起胚胎发育异常的机制,使用荧光定量PCR法检测暴露于0.5和2.0mg/L苯醚甲环唑后,斑马鱼胚胎中与发育相关的11个基因的表达量变化。结果发现处理后,斑马鱼胚胎IGF-1、GH、BMP2和BMP4这四个基因表达水平显著下降,而HEl和CYP26A1表达显著上调。 3.苯醚甲环唑对斑马鱼抗氧化系统的影响 分别将斑马鱼成鱼和胚胎暴露于0.01、0.50和1.00mg/L的苯醚甲环唑溶液中,暴露持续8天。分别在暴露后第4和8天时,测定成鱼肝脏和胚胎中三种抗氧化酶的活性以及编码这三种酶的基因表达量。另外,使用硫代磷酸巴比妥酸法测定MDA含量,以检测苯醚甲环唑造成的氧化损伤。酶活性与基因表达结果表明,1.0mg/L苯醚甲环唑处理后斑马鱼成鱼肝脏和胚胎中SOD、CAT和GPx的活性显著下降,同时伴随着这些酶的编码基因表达水平显著下调,而成鱼肝脏中的抗氧化因子被抑制程度要高于胚胎。MDA含量测定结果发现斑马鱼成鱼肝脏暴露后出现了明显的脂质过氧化,而在胚胎中并未发现MDA含量显著变化。 4.苯醚甲环唑对斑马鱼脂类含量的影响 将斑马鱼胚胎和成鱼暴露于0.01、0.50和1.00mg/L的苯醚甲环唑水溶液中。分别在暴露后第4和8天时测定处理后成鱼肝脏和胚胎中胆固醇、甘油三酯的含量以及与脂类合成和代谢相关的6个基因的表达情况。生化试验结果表明试验浓度下苯醚甲环唑不能明显影响斑马鱼胚胎和成鱼肝脏中的胆固醇和甘油三酯含量。荧光定量PCR结果表明,苯醚甲环唑处理8天后成鱼和胚胎中脂类相关的基因表达水平均出现显著变化。胚胎中CYP5I和HMGCRa表达上调,FAS、ACC1、SREBF和PPARal表达下调;而成鱼肝脏中这六种基因均表现出显著下调。 5.苯醚甲环唑长期暴露对斑马鱼成鱼胆固醇含量影响 将不同性别的成年斑马鱼分开长期(30天)暴露于0.1、10和500μg/L几的苯醚甲环唑水溶液中。分别在暴露后7、15和30天时检测肝脏中胆固醇含量以及与胆固醇合成代谢相关的9个基因的表达水平。生化试验结果表明,雄性斑马鱼在500μg/L苯醚甲环唑暴露15天后肝脏中的胆固醇含量显著下降,而该影响在30dpe时进一步加强。而雌性斑马鱼肝胆固醇含量在整个暴露期间没有显著变化。此外,雌雄斑马鱼在苯醚甲环唑处理后体重均显著下降,但是雄性个体的下降程度要明显高于雌性个体。上述结果表明,雌性斑马鱼对苯醚甲环唑表现出更强的耐受能力。基因表达结果进一步发现斑马鱼雄鱼在暴露后15天和30天时,肝脏中胆固醇合成基因CYP51、HMGCRa、HMGCRb、DHCR7、DHCR24、SQLE、FDFP1、IDI1表达均显著下降。而雌鱼肝脏中这8种基因虽然在暴露后第7天时显著下调,但是随着暴露时间延长,其下调作用逐渐减弱,在暴露30天时CYP51a、HMGCRa、sQLE和DHCR24较对照组表现出上调。


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