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新孢子虫MIC6的鉴定、功能及其作用机制的初步研究

李文生  
【摘要】:新孢子虫(Neospora caninum)是一种专性细胞内寄生原虫,可感染多种动物。新孢子虫在入侵宿主细胞过程中会分泌大量蛋白质,微线体分泌的多种蛋白(microneme proteins, MICs)在虫体识别、粘附细胞中发挥重要功能。关于微线蛋白的研究已经见于多种顶复亚门原虫,而新孢子虫微线蛋白的研究报道则很少。本研究以NcMIC6为主要研究对象,对NcMIC6的生物学特性、与其它微线蛋白相互作用、功能及其作用机制等进行较为系统的研究。 应用生物信息学方法对NcMIC6进行分析,结果显示NcMIC6基因全长984bp,无内含子,与弓形虫MIC6核苷酸序列的相似性是81%;该基因共编码327个氨基酸,与弓形虫MIC6氨基酸序列相似性为47%。利用在线分析软件发现,NcMIC6蛋白含有1个信号肽,1个跨膜区,3个EGF domain口2个低聚区,属于I型跨膜蛋白。 构建原核表达质粒pET28a-NcMIC1、pET28a-NcMIC4和pET28a-NcMIC6,原核表达重组蛋白rNcMIC1、rrNcMIC4和rNcMIC6。用这三种蛋白分别免疫小鼠,制备anti-rNcMIC1、anti-rNcMIC4和anti-rNcMIC6多克隆抗体。对NcMIC6生物学特性的研究显示:细胞内虫体的NcMIC6集中于虫体前端,而正在入侵细胞的虫体NcMIC6则位于虫体后端;体外入侵阻断实验结果表明,anti-rNcMIC6多抗可有效阻止新孢子虫入侵宿主细胞;微线蛋白分泌试验发现,当温度高于25℃或虫体内钙离子浓度升高时,虫体会分泌大量NcMIC6。 对NcMIC6与其它相关蛋白的相互作用进行研究。免疫共沉淀实验结果证实,NcMIC6与NcMIC1和NcMIC4会发生相互作用。GST-pull down勺结果显示,NcMIC1分别与NcMIC4和NcMIC6相连,其中只含有第三个EGF domain的NcMIC6可与NcMIC1发生相互作用;对带GST标签的NcMIC6羧基端蛋白通过GST-pull down筛选出与其相互作用的蛋白是新孢子虫醛缩酶(NcALD)。在细胞外进行醛缩酶结合试验,表明NcMIC6羧基端中的色氨酸在NcMIC6与NcALD的相互作用中发挥重要作用。把色氨酸突变为丙氨酸后,NcMIC6与NcALD的结合能力明显下降。间接免疫荧光实验显示,NcMIC6与NcALD在虫体内部分共定位于虫体前端。 构建原核表达质粒pET28a-rNcMIC1-4-6,表达嵌合蛋白rNcMIC1-4-6,与重组蛋白rNcMIC6分别免疫小鼠,通过检测小鼠的相关免疫学指标和攻虫后脑内荷虫量,分别对rNcMIC6和rNcMIC1-4-6的免疫原性及对小鼠的免疫保护力进行评价。抗体检测结果表明,rNcMIC6和rNcMIC1-4-6都能刺激小鼠产生高滴度的抗体。细胞因子检测结果显示,小鼠免疫rNcMIC6和rNcMIC1-4-6后血清中IL-4含量显著升高。脑内荷虫量检测结果显示,免疫了rNcMIC6和rNcMIC1-4-6的小鼠在攻虫36天后,脑内荷虫量显著降低。以上结果说明这两种蛋白均对小鼠人工感染新孢子虫有一定的免疫保护力,可作为新孢子虫疫苗研究的候选抗原。


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