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谷子microRNAs及其靶基因的鉴定与功能分析

易飞  
【摘要】:microRNAs (miRNAs)是一类长度约为21个核苷酸的内源单链非编码RNA,在植物器官建成、生长发育和逆境应答等过程中发挥重要的调控作用。谷子(Setaria italica)是一种重要的粮食作物和能源作物,抗旱性和节水性突出。本研究将在全基因组水平上挖掘和研究谷子的miRNA,并利用降解组数据对其靶基因和前体的剪切方式进行分析,同时通过分析PEG处理前后的降解组和转录组数据,揭示谷子mRNA去帽降解途径及其干旱应答模式。基于本研究新产生的谷子幼苗地上部分和已发表的谷子根,叶和花组织的小RNA数据,我们对谷子中miRNA进行了鉴定。结果显示,除了43个已知的miRNA,还发现了172个新的miRNA和2个mirtron miRNA。不同的miRNA家族有不同的组织表达模式,同一家族的不同成员也具有不同的组织表达模式,其中10个miRNA的组织表达模式通过stem-loop qRT-PCI得到了验证。另外,我们还对miRNA的靶基因进行了预测,找到了166个niRNA的共447个靶基因,GO富集分析显示它们主要在代谢过程调控、基因表达调控和核酸结合蛋白三个方面有功能富集。5'RACE验证了其中4个靶基因。共线性分析发现谷子和高粱中存在69对有共线关系的前体,表明:miRNA在进化上保守。为了鉴定谷子miRNA的靶基因和研究ncapped mRNA的干旱应答模式,我们构建了PEG处理前后的谷子幼苗地上部分的降解组文库并进行测序。利用降解组数据,一共鉴定了238个潜在的miRNA靶基因,发现miRNA成熟途径不仅存在经典的"loop-last"方式,还存在特殊的"loop-first"途径。结合转录组数据,将RNA根据响应干旱胁迫方式的不同分成4类。Type-Ⅰ基因在干旱胁迫后,转录本的合成和降解呈相同趋势变化,GO富集分析显示这一类基因的功能主要富集于氧化还原酶活性,表明这一类基因可能在谷子干旱胁迫条件下对清除ROS、维持氧化还原平衡方面具有重要作用。Type-Ⅱ基因由于其在干旱胁迫过程中基因的降解水平变化显著而表达水平不发生变化,所以只通过转录组数据很难检测到。大部分Type-Ⅱ基因编码的蛋白为转录因子,如WRKYs, MYBs和NACs类转录因子。Type-Ⅳ基因在干早胁迫中降解水平不发生变化,而表达水平变化显著。GO富集分析显示Type-Ⅳ基因主要在催化作用相关term中有功能富集,如水解酶,异构酶和过氧化物酶等,表明Type-Ⅳ基因可能作为内在的防御工具来抵御干旱胁迫。另外我们还发现11个编码参与C4途径相关酶的基因为干旱胁迫响应基因。我们选取根中表达量高的sit-miR396,对其功能进行研究。结果异源表达sit-miR396的转基因拟南芥叶片变小,叶片数目变多,根长变短和株高变矮等。过表达sit-miR396的谷子株高变矮和根长变短。生物信息学预测sit-miR396在谷子中有10个靶基因,功能注释为生长调节因子(GRF),其中7个能在降解组数据中检测到。进一步分析发现有6个GRFs在sit-miR396过表达谷子株系中的表达量有不同程度的下降。sit-miR396的功能及参与调控谷子根发育的具体机制还需要进一步的研究。


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